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1. Die Differenzierung von Zellen und ihre Organellen ist aller Wahrscheinlichkeit nach ein Vorgang von Schwingungen, bei denen die Proteine (Apoenzyme) durch ihre Länge und Form die Relaxation bestimmen. Diffusionsgradienten können dabei durchaus eine Rolle spielen, sind aber oft nicht ausreichend präziese genug. Nach dieser Vorstellung hat man sich Zellen und Organellen als dreidimensionale Chaldni'sche Klangfiguren vorzusellen, in denen Schwingungsbäuche und Schwingungsknoten Orte der Bewegung bzw. der erhöhten Reaktion sind. Diese Vorstellung erlaubt es zu verstehen, wie es kommen kann, daß Zellwände von beiden Seiten gleichzeitig lytisch angegriffen werden. Die in Lehrbüchern gemachte Angabe, daß Plasmodesmen und Tüpfel dadurch entstehen, daß beim Aufbau der Zellwand die Plasmodesmen ausgespart werden, reicht zur Erklärung dieser Zellkommunikation nicht aus, weil es beim Streckungswachstum zu einer Verarmung an Plasmodesmen käme. Die Vorstellung, daß Moleküle und Molekülverbände mit korrespondierender Frequenz bevorzugt in Reaktion miteinander treten, wird von der Strukturmechanik gestützt (in gepackter Form etwa 560 KB).
2. Die osmotische Gewebespannung, so wie sie in Schul- und Lehrbüchern dargestellt wird, vernachlässigt meist die Spannung unter der Zellen normalerweise stehen, und die erst bei Plasmolyse sichtbar wird. Die unterschiedliche Dehnbarkeit von Bastzellen erklärt deren statische Bedeutung.

ÜBER DIE DIFFERENZIERUNG VON ZELLVERBÄNDEN AUS DAUCUS CAROTA L.

AUF SYNTHETISCHEN NÄHRMEDIEN.

zur Erlangung der Doktorwürde, vorgelegt dem Fachbereich Biologie der Freien Universität Berlin, von Dipl. -Biol.
WALTHER UMSTÄTTER
geboren in Ploesti (Rumänien)

Damit war die Voraussetzung geschaffen, begrenzte Zellverbände aus ihrer räumlichen und korrelativen Hemung herauszunehmen und in Abhängigkeit exakt bestimmbarer Umweltfaktoren, ihre veränderten Potenzen, sowie die entsprechenden Umdifferenzierungen, genau in studieren.

Seit SACHS (1874) verstehen wir unter Differenzierung die von einem Meristen ausgehende Entwicklung in den strukturell und funktionell unterschiedlichen Dauergeweben. D geht nach JOST (1923) mit der Arbeitsteilung die physiologische Selbständigkeit der Zellen verloren, wodurch die Lebensfähigkeit nur im Verband des differenzierten Ganzen bestehen bleibt.  Auf die damit verbundene "innere Verkettung und wechselseitige Beeinflussung in selbstregulatorischer Weise für das harmonische und zweckentsprechende Zusammenwirken der Organe der Pflanze und der Zellen eines Organes" hat PFEFFER (1904) hingewiesen. PFEFFER vertrat dabei die Ansicht, "daß also die Ontogenese, um mit DRIESCH zu reden, eine epigenetische Evolution vorstellt". In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß ZIMMERMANN (1953) das "Rosasche Differenzierungsgesetz" durch seinen Vergleich der verschiedenen Zell.typen, im Laufe der Phylogenese, präzisiert hat und dabei etwa 70 Zellsorten bei den höheren Pflanzen unterscheidet.

Die Frage, wie weit Differenzierungen reversibel sind, wurde von WEISS (1949) einer näheren Betrachtung unterzogen. Dabei sollten definitionsgemäß im Gegensatz zur Modulation,Differehzierungen permanent bestehen bleiben, also auch bei Verlust des initiierenden Faktors. Eine weitere Unterscheidung trifft HOLTZER (1968) bei biochemisch differenzierten Zellen. Neben der Produktion essentielles Moleküle, die in allen Zellen benötigt werden, sind sogenannte "luxury molecules" die Bausteine, welche die Differenzen der Zellen deutlich zeigen sollen. HOLTZER konnte 1973 an tierischem Material nachweisen, daß eine molekulare Information, die von der Mutterzelle nicht aufgenommen werden konnte, in der Tochterzelle zu entsprechenden Veränderungen führte. Er kommt zu dem Schluß, daß als Voraussetzung für die Differenzierung die Zell- bzw. Kernteilung anzusehen ist.

Diese Erscheinung ist auch bei niederen Pflanzen zu beobachten, bei denen durch differentielle Zellteilung Unterschiede, z.B. im Generationswechsel, entstehen. Bei höheren Pflanzen entscheidet dagegen meist das "Gesetz der Lage", die sogenannte modifikatorische Differenzierung. Es werden dabei nach MOHR (1971) zwei Phasen unterschieden: Die primäre Differenzierung, sie entspricht in etwa der Determinationsphase, und die sekundäre Differenzierung, sie entspricht in etwa der Aktivierungsphase.

Betrachtet man die, in der "Biogenetischen Grundregel" (HAECKEL 1866) enthaltene Erkenntnis MÜLLER'S (1864), so spiegelt sich in ihr die Tatsache wieder, daß in der Ontogenese wie in der Phylogenese jede Phase der Entwicklung von der Einzelzelle bis zum erwachsenen Organismus lebensfähig sein muß. Somit ist das System also stabil und steht trotz veränderlicher Umwelt und epigenetischer Entwicklung, jederzeit korrelativ unter Kontrolle. Die höhere Pflanze, ist ein sich
ständig in physiologischen Grenzen variierendes, und sich optimierendes System, deren differenzierte Gewebe sich gut isolieren, kultivieren und analysieren lassen.

Die gezielte Veränderung der Umwelt, im Rahmen der physiologisch möglichen Grenzen der Zellverbände, ist für die Klärung dieses Problemkreises eine wesentliche Voraussetzung.

Durch die Explantation von Geweben gewünschter Größe, auf genau bestimmte synthetische Nährmedien, soll hier die Frage nach der Abhängigkeit der Differenzierungs-und Wachstumsvorgänge untersucht werden. Dies war auch das Ziel HABERLANDTIS, der bereits 1902 versucht hatte, Aufschlüsse "über die Wechselbeziehungen und gegenseitigem Beeinflussungen, denen die Zellen innerhalb des vielzelligen Organismus ausgesetzt sind", zu gewinnen Die vorliegende Untersuchung ve rfolgt dieses Ziel an dem Objekt Daucus carota L.
 

1. Kultivierung und Bestimmungen zum Wachstum

Zur Oberflächensterilisierung sind die geschälten Rüben für 45 min in Kalziumhypochloridlösung, etwa 2%ig an Chlor (JAMES 1915), getaucht worden. Die Explantation erfolgte unter aseptischen Bedingungen (GAUTHERET 1959), auf 10 ml 0,8%igen Schrägagar in Kulturröhrchen mit Aluminiumfolie, bzw. in Anumbra Petrischalen (5 cm0) mit Parafilm verschlossen. Bei Suspensionskulturen dienten Erlenmeyerkolben, mit 50 U/min geschüttelt, als Behälter. Die Kulturen wurden in einer Phytokammer bei 28 1 loC, 80%iger relativer Feuchte und Dunkelheit gehalten und in 4-wöchigem Rhythmus übertragen.
Als Medien kamen daevon  WHITE (1954) und das von MURASHIGE und SKOOG (1962) mit den "plant organics" nach WHITE zur Verwendung. Nähere Angaben hierzu bei REINERT, BACKS und KROSING (1966). Neben 2% Saccharose enthielten die Medien 5 . 10-8 g/ml 2,4-Dichlorphenoxiessigsäure (254-D); bei Kultivierung von Monokotylen betrug der 2,4-D Gehalt das zwanzigfache. Der pH Wert wurde mit Natronlauge auf 5,8 eingestellt. Durch 20 min Autoklavierung bei 1 Atü konnten Infektionen im Medium ausgeschlossen werden.

Die Explantate, zumeist der Kambiumregion entnommen, ließen sich leicht mit einem Korkbohrer ausstechen und je nach Ausgangsgröße mit keimfreien Rasierklinge oder Skalpell zurechtschneideri. Dies gelang bis zu Geweben von weniger als zwanzig Zellen.

Kulturen, deren Frischgewicht bestimmt werden sollte, wurden rasch mit aqua dest. von den anhaftenden Agar-Resten befreit, sofort mit "Kleenex" abgetupft und auf einer Feinwaage auf Milligramm genau gewogen. Dabei wurden auf einen gleichmäßigen und raschen Ablauf der Versuchsbedingungen geachtet. Zur Trockengewichtsbestimmung wurden die Gewebe lyophilisiert.
Veränderungen der Zellgröße, die meist mit Formänderungen einhergehen, sind quer zur optischen Achse des Mikroskops, mit Hilfe eines Okularmikrometers, im Längs-, Quer- und Tangentialschnitt gemessen worden. Ähnlich wurde bei der Bestimmung der Zellzahl verfahren. Hier war es wichtig auf eine möglichst geringe Tiefenschärfe zu achten, um nicht Zellen aus unterschiedlichen optischen Ebenen mit zu berücksichtigen.

Die Bestimmung der Mitosen erfolgte nach Behandlung der Kulturen mit frisch angesetzter 0,01%iger Colchicin-Lösung. Dazu kamen die Kulturen für 8h in ein entsprechendes Kulturmedium mit dem Metaphasegift. Anschließend wurden dünne Handschnitte angelegt, die über Nacht in 3 Teilen Carnoy und 1 Teil Orcein - Essigsäüre (Ig Orcein in 100 ml 50%iger Essigsäure) lagen. Die Schnitte mußten anschließend in 1 ml reine Orcein - Essigsäurelösung überführt, und 3 x im Reagenzglas erhitzt werden. Auf einem Objekträger gespreitet, sind Quetschpräparate angefertigt worden, die sofort zur Untersuchung gelangten.
 

2. Bestimmung des osmotischen Wertes und der Saugkraft

Bei den grenzplasmolytischen Bestimmungen kamen Handschnitte zur Anwendung, die für 15 min in die Saccharose-Konzentrationsreihe gelangten (20 0 C). Schnitte, deren Plasmolysegrad schwer zu erkennen war, erhielten einen Zusatz von Neutralrot im Verhältnis von 1 : 10.000 (STRUGGER 1949). Die Saccharc)selösungen wurden mit Leitungswasser angesetzt, wobei die Verschiebung des osmotischen Wertes berücksichtigt wurde.

Die Saugkraft ließ sich in Abwandlung der Methode von PRINGSHEIM bestimmen; indem möglichst kleine Kuben aus dem Gewebe geschnitten, kurz mit Leitungswasser abgespült, mit "Kleenex" abgetrocknet und sofort gewogen wurden. Danach lagen sie 1 h in den entsprechenden, vorher evakuierten Saccharase-Lösungen und wurden abermals abgetrocknet und gewogen. Zur Bestimmung des Volumens der Interzellularen ließ sich eine Vakuuminfiltration in äquimolalen Medium anschließen. Die dabei aufgenommene Flüssigkeitsmenge entspricht dem vom Glas erfüllten Raum des Gewebes.
 

3. Die manometrische Methode nach 0. Warburg

4. Enzymatische Bestimmungen

a.) Bestimmungen an Schnitten

Testansätze:

Alkoholdehydrogenase EC 1.4.1.3

2,69 ml Puffer Tris/HCl 0,2 M pH 8,8
0,10  "  Äthanol 96%ig
0,20  "  NAD (40 mg/2 ml) Temperatur: 25°
0,01  "  Glutathion (18 mg/0,5 ml)
Gemessen wurde am Filterphotometer (Eppendorf) bei 366 nm.

2,1 ml Puffer Tris/HCl 0,2 M pH 8.15
0,5  "  NADH+H⁺ (20 mg/ml)
0,2  "  (NH₄₎ SO₄ (198 mg/ml)  Temperatur: 25° C
0,2  "  a-Ketoglutarat (29,2 mg/ml)
Wellenlänge: 340 nm

2,2 ml Phosphatpuffer nach Sörensen pH 7,0
0,6  "  NADH+H⁺ (1 mg/ml)  Temperatur: 25° C
0,2  "  Natriumpyruvat (3 mg/ml)
Wellenlänge: 340 nm

1,0 ml Acetatpuffer pH 4,8  5,5 mM an p-Nitrophenylphosphat und 5 mM an MgCl₂
10 min bei 300° C inkubiert
10 ml 0,02 N NaOH
Wellenlänge: 405 nm

b.) Bestimmungen an Extrakten

Testansätze:

Alkohol-Dehydrogenase
Ansatz wie oben, jedoch mit 0,1 ml Extrakt.
Peroxidase EC 1.11.1.7
2,7 ml Phosphatpuffer nach Sörensen pH 7,0
0,1 ml Guajacol (0,2 ml/100 ml)
0,1 ml H₂0₂ (Merck) (0,1 ml/100 ml) Temperatur: 25° C
0,1 ml Extrakt
Wellenlänge: 436 nm

10 Gewebe wurden mit 3 g Seesand in 30 ml Tris/HCl-Puffer ( 0,05 M pH 7,6 mit 0,5 M Sorbit, 1mM Äthylendiamintetraessigsäure, l % Polyäthylenglykol 20.000 und 0,01 M Mercaptoäthanol) im eisgekühlteit Mörser fein zerrieben und durch "Miracloth" gepreßt. Anschließend wurde der trübe Extrakt bei 500 x g 10 min. in der Kälte abzentrifugiert. 25 ml des Überstandes kamen für 1 h erneut zur Zentrifugation bei 30. 000 x g und 3° C. Das Präzipitat ließ sich in 8 ml des Sorbitol - Puffers gut suspendieren. Vier Milliliter dieser Suspension gelangten auf einen Stufengradienten mit 15, 20 und 35% Saccharose. Die Zentrifugation erfolgte mit der Sorvall OTD-2 und dem Beckmann Rotor SW-25.1 in 2 h bei 90.000 x g. Zur besseren Sichtbarkeit der Fraktionen konnte Neutralrot (in einer Verdünnung von 1 : 10.000) ohne erkennbare Aktivitätsverminderung der Enzyme zugesetzt werden. In den einzelnen Fraktionen ist die saure Phosphatase nach Zusatz von Triton - X114 mit dem oben beschriebenen Testansatz bestimmt worden. Entsprechend wurde auch mit den 500 x g Präzipitaten verfahren.

1,0 ml 0,125 Natriumcacodylat, darin gelöst 4 mg RNS (von Bruchstücken befreit)
0,5  "   0,5 N HCl
mit Imidazol (136 mg/10 ml) auf pH 5,0 gebracht
mit H₂0 auf 2,5 ml aufgefüllt
0,5 ml Extrakt - Inkubation: 30 min bei 37° C
0,5  "  25%ige Perchlorsäure mit 0,75% Uranylacetat
Wellenlänge: 260 nm

c.) Histochemische Nachweise

Testansätze:

Glutamat-Dehydrogenase (FINE und COSTELLO 1963)
 
9,9 ml Phosphatpuffer nach Sörensen pH 7,0 mit
169,12 mg Natriumglutaminat
    8,00  "   NAD
    4,00  "   Nitroblautetrazolium
    0,25  "   Phenazinmethosulfat
 0,1 MgCl₂*6H₂0 (10%ig)
Die Kontrolle wurde mit Natriumazid (3 mg/10 ml) behandelt.
Peroxidase
7,0 ml H₂0 + 115 mg Natriumacetat
2,0 ml (88 mg Benzidin in 5 ml Essigsäure + 45 ml
H₂0 + 336 mg Guajacol)
0,5 ml MnS0₄ (59 mg/50 ml)
Davon 4,5 ml + 0,5 ml H₂0₂ (0,5 ml/50 ml)
Kontrolle mit H₂0 statt H₂0₂
Cytochromoxidase EC 1.9.3.1
25 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,4
  1  "   1%ige a-Naphthollösung in 40%igem Äthanol gelöst.
  1  "   1%ige Dimethylparaphenylendiamin-hydrochloridlösung
Kontrolle mit 0,001 M KCN versetzt.
Phenoloxidase EC 1.10.3.1
Schnitte in Sörensen's Phosphatpuffer pH 7,4 mit 0,1% Brenzcatechin (Merck).
Dopa-Oxidase nach GLICK (1949)
Entsprechend Phenoloxidase, jedoch statt Brenzcatechin 0,1% 3,4-Dihydroxiphenylalanin.
Saure Phosphatase
9 ml Acetatpuffer pH 5,0 mit 12 mg Bleinitrat
10 MgCl₂* 6H₂0 und 30 mg Natriumglycerophosphat
Nach der Inkubation wurde abgespült und anschließend 1 min. in 1%iger Ammoniumsulfidiösung entwickelt.
Kontrolle ohne Substrat.
ATPase EC 3.6.1.3
3 ml aqua dest. mit 15,2 mg Adenosin-51-triphosphat.Na 2- Salz
2  "  0,1 M Natriumbarbiturat
1  "  0,18 M CaC1 2
mit 0,1 M NaOH auf pH 9,4 gebracht und auf 10 ml aufgefüllt. Eventuelle Trübungen wurden abfiltriert. Nach der Inkubation wurde mit 1%iger CaCl₂- Lösung kurz gewaschen, 3 min. in 2%iger CoCl₂ Lösung eingelegt, mit aqua dest. gespült und (s.o.) 1 min in 1%iger Ammoniumsulfidlösung entwickelt.
Kontrolle ohne Substrat.
Esterase nach MARKERT und HUNTER (1959)
100 ml 0,05 M Veronalpuffer
   1   "  a-Naphthylacetat (2%ig in Aceton gelöst)
100  "  Fast Blue RR
Esterase nach ROTMAN und PAPERMASTER 1963 (verändert)
5 mg Fluroseeindiacetat in
1 ml Aceton gelöst und mit Nährmedien pH 5,8 auf eine Endkonzentration von 10^{- 6} M verdünnt.

5. Quantitative Bestimmung

a.) Bestimmungen an Extrakten

Ammonium wurde in Conway- Diffusionsschalen, nach Angaben von BALLENTINE (1957) nachgewiesen, und ebenso wie Nitrat, nach der Phenol-disulphonsäureMethode von SNELL und SNELL (1959), bei 405 nm photometriert.

Die Glucose-Bestimmung erfolgte nach der HexokinaseMethode (Boehringer Mannheim). Dazu wurde in aqua dest. extrahiert und anschließend abzentrifugiert.

Im Präzipitat enthaltene Stärke ließ sich mit Amylase (3 mg/100 ml Puffer bei pH 5,0) spalten und als Glucose nachweisen.

Durch Titration mit 2,6-Dichlorphenolindophenol (Tillmannsche Methode) konnte die Ascorbinsäure in ihreireduzierten Form nachgewiesen werden (FRANKE 1956).

Zur Fe⁺⁺⁺- Bestimmung gelangte 1 ml Extrakt in eine Lösung von 1 ml N HCl und 1 ml 1 N KSCN. Anschließend wurde mit 3 ml ausgeäthert und im Beckmann Spektralphotometer-DK-2A bei 500 nm gemessen.

ß-Carotin Bestimmung: Das Gewebe wurde mit Seesand und Methanol im eisgek'U4hlten Mörser zerrieben und die gefilterte klare Methanollösung im Scheidetrichter mit Petroläther geschüttelt.

Da bei Karotten der weitaus überwiegende Teil der Pigmente ß-Carotin ist, lag eine ausreichend reine Fraktion vor, die mit synthetischer Substanz (Merck) quantitativ verglichen wurde.
 

b.) Bestimmungen an Schnitten

Nachweis der DNS in Zellkernen: Bei der microfluorometrischen Methode von RUCH (1966) ließen sich die
Vorteile des Fluoreszenz - Auflichtilluminators nach Ploem (Leitz) voll ausnutzen. Sowohl die geringe Störung des "backgrounds" durch günstige Ausblendung, als auch die Möglichkeit dickere Schnitte verwenden zu können (bei RUCH maximal 10 m) , brachte große Vorteile. Dazu kommt die hohe Lichtausbeute bei starken Vergrößerungen und hohen Aperaturen.
"Feulgenfärbung"
1 h Alkohol-Eisessig 3:1
10 min. waschen in Leitungswasser
  8   "    Hydrolyse in 6 N HCl bei 25v C
  5   "    in Wasser spülen
2 h in frisch angesetzter Lösung färben: 10 ml 0,2% Auramin 0, 1 ml N HCl, 0,5 ml 10%ige NaHSO₃
2 min. 180 ml aqua dest, 10 ml N HCl, 10 ml 10% NaHSO₃
2   "                                  "                    "
2   "                                  "                    "
10 min. waschen in Leitungswasser
Einbettung in Glycerin und sofortige Messung am Zytophotometer.
Die microfluorontetrische Ausrüstung bestand aus einem Leitz Ortholux, dem Microphotometeransatz und einem Verstärker mit ultrastabilisiertem HochspannungsNetzteil (Knott - Electronic, München). Als Lichtquelle diente eine Xenon Hochdruck Lampe (Leitz).

Bestimmung des Proteingehaltes in den Zellkernen (MAZIA, BREWER, ALFERT 1953).
Möglichst dünne Gefrierschnitte gelangten für 2 h in eine Farblösung aus l% HgCl 2' 0,05% Bromphenolblau in 2%iger Essigsäure. Anschließend wurde für 5 min mit 0,5%iger Essigsäure gespült und unmittelbar in tertiäreni Butylalkohol entwickelt. Es wurde die Zweiwellenlängen-Methode nach ORNSTEIN (1952) und PÄTAU (1952), bei Wellenlängen 600 nm und 637 nm angewandt. (Korrekturtabelle von MENDELSOHN 1958).

c.) Qualitative Bestimmungen an Schnitten

Stärke: Reaktion mit Lugolscher Lösung

Fe⁺⁺: Turnbullblau - Methode (MOLISCH 1923) 2%ige Lösung von K₄Fe(CN)₆ in S%iger HCl.
Fe⁺⁺⁺: Berlinerblau - Methode

Wie bei Fe⁺⁺  jedoch mit K₃Fe(CN)₆
Die Schnitte wurden unter kräftigem Wasserstrahl gespült und nur mit Glasgeräten berührt, um Verunreinigungen durch Abrieb von Eisenteilchen zu umgehen.
Histone nach ALFERT und GESCHWIND (1953)
15 min bei 90° C in 5%iger Trichloressigsäure inkubieren
10   "   in 70%igem Alkohol (3 x wiederholen)
  5   "   in aqua dest. spülen
30   "   in 0,1%iger Fast Green Lösung pH 8,0
  5   "   in aqua dest. spülen

6. Zytologische Untersuchungen

Mitochondrien waren in Form und Größe im Phasenkontrast als solche zu erkennen und von den oben genannten Organellen gut abgrenzbar. Zusätzlich konnte bei ausreichender Sauerstoffversorgung mit 0,01%iger Janusgrün-Lösung vitalfluorochromiert werden.

Stärkekörner und Kristalle waren im Polarisationsmikroskop von den anderen Gruppen klar unterscheidbar.
 

Abkürzungen

M_W - Nährmedium nach WHITE (1954)
M_S - Nährmedium nach MURASHIGE und SKOOG (1962) modifiziert nach REINERT, BACKS und KROSING (1966).
M_SW - 1 Teil M_W und 1 Teil M_S gemischt.
 

mMol/10 ml Medium	MW	MS
Kationen:  Ca++	12,200	30,000
Co+	------	0,001
Cu ++	------	0,001
Fe++	------	1,000
Fe+++	0,130	-----
K+	16,700	200,550
Mg++	29,900	15,000
Mn++	0,296	1,000
Na+	29,270	2,000
NH+	------	206,000
Zn++	0,094	0,369
Anionen    BO3- - -	0,24	1,00
Cl -	8,72	60,00
J -	0,05	0,05
MoO4- - - -	------	0,01
NO3-	32,33	394,00
PO4- - -	1,07	12,50
SO4- -	44,29	17,37

"Plant organics" mg/10 ml Medium in MW und MS gleich.  Glycin 30,0; Pyridoxin-HCl 1,0;  Nicotinsäure 5,0; Thiamin-HCl 1,0  2,4-Dichlorphenoxiessigsäure  0,5;  Sacchorose 200.000

In den graphischen Darstellungen mit statistischer Auswertung bedeutet (n=Stichprobenumfang). In den Zeichnungen und Fotos bedeutet: B=Bast, H=Holz und K=Kambium.
 

Ergebnisse

I Wachstum der Explantate

1. Frischgewichtszunahme

Explantate, deren Frischgewicht in regelmäßigen Abständen bestimmt wird, zeigen zu Beginn der Kultivierung einen annähernd konstanten Anstieg. Dabei läßt sich ein Zusammenhang zwischen Ausgangsgröße und absolutem Zuwachs erkennen (Abb. 1). Explantate mit einem Ausgangsgewicht von 1 mg haben ein Inkrement von etwa 0,06, während solche von 150 mg eines von etwa 3,3 aufweisen. Unter Vernachlässigung der auftretenden Streuungen läßt sich an der Graphik erkennen, in welchem funktionellen Zusammenhang der prozentuale Zuwachs zum Gesamtgewicht des jeweiligen Explantates steht. Hier zeigt sich, daß mit abnehmender Ausgangsgröße das relative Wachstum exponentiell zunimmt.

Geht man nun davon aus, daß das neu hinzugekommene Frischgewicht eine Funktion des schon vorhandenen Gewebes ist, so kann man vermuten, daß ein allometrischer Zusammenhang besteht. Nach HUXLEY (1936) läßt sich demzufolge schreiben:

Bei logarithmischer Auftragung muß sich somit eine Lineare ergeben, die sich über eine entsprechende logarithmische Koordinatentransformation als Regressionsgerade berechnen läßt. Das Steigmaß dieser Geraden entspricht dem Exponenten a. der Schnittpunkt mit der Ordinate legt die Konstante b fest.

Für die untersuchten Kulturen ergaben sich damit die Beziehungen:

Abb. 1. Verhältnis der prozentualen Zuwachsrate zum Ausgangsgewicht der Explantate.
o o o = Kulturen auf M_W
+++  = Kulturen auf M_SW
. . .   = Kulturen auf M_S
Abb.2 a-c. Graphische Darstellung der Regressionsgeraden nach logarithmischer Koordinatentransformation der in Abb. 1 enthaltenen Messwerte. Die einhüllenden Kurven zeigen den Vertrauensbereich für die Mittelwerte, bei einer Konfidenzzahl von = 95%. y = Zuwachs/Zeiteinheit  x = Ausgangsgewicht.

Abb. 2a. Gewebe auf M_W explantiert. (n=40)

Abb. 2b. Gewebe auf M_SW explantiert (n = 23)

Abb. 2c. Gewebe auf M_S explantiert (n = 40)

Bei einem Vergleich der drei Regressionsgeraden wird ersichtlich, daß die Steigmaße vernachlässigbar geringe Unterschiede aufweisen, während die drei benutzten Medien sich auf den Faktor b auswirken (Abb. 3). Die Größe des Faktors a mit etwa 0,69 läßt eine Relation zur Oberfläche vermuten. Da nach BERTALANFFY (1951) die Oberflächenbeziehung

O = G^2/3

besteht, worin O = Oberfläche, und G = Volumen bedeutet. Im strengen Sinne müßte demnach der Faktor a bei 2/3=0,666 liegen. Es muß jedoch berücksichtigt werden, daß die Explantate ausgestochene Zylinder und im Grenzalle Scheiben darstellen. Der Faktor 0,69 ist daher näherungsweise als recht gut anzusehen. Die Bedeutung von b ist nicht so einfach zu erkennen, da diese Konstante mherere Einflüsse mit unterschiedlicher Wirkung eingehen. Hier kommen alle Umweltfaktoren, wie Hydratur, O₂-, CO₂- und Äthylengehalt des Gasraumes sowie die Zusammensetzung der Nährmedien in Frage. Ein wesentliches Merkmal der Wachstumsfunktion ist ihre Stetigkeit, die sich in dem Bereich von weniger als einem Milligramm bis hinauf zu hundertfünfzig Milligramm Frischgewicht der Explantate verfolgen ließ. Die hyperbolische Form der Abbildung 1 läßt sich auch durch die Gleichung

beschreiben. Darin verdeutlicht sich bei immer stärkerer Freisetzung von Zellen aus dem Zellverband eine kontinierlich steigende Tendenz an relativer Wachstumsintensität.
Abb. 3. Vergleich der in Abb. 2 a-c enthaltenen Regressionsgeraden.  S = Kultur aus M_S; SW = Kultur auf M_SW; W = Kultur auf M_W. Der Einfluß der Medien bewirkt eine Parallelverschiebung in den Ordinatenschnittpunkten und damit der Konstanten b.


Wieweit eine Extrapolation der Regressionsgeraden erlaubt ist, zeigt sich an sehr kleinen Geweben, die in Petrischalen explantiert, und die mit einem Inversmikroskop beobachtet wurden. Hier waren würfelförmige Stücke von 180 x 200 x 150 m (etwa 0,005 mg) technisch noch erreichbar, jedoch bei weitem nicht mehr wachstumsfähig. Dabei wurde darauf geachtet, daß im Inneren des Explantates noch Zellen mit Plasmaströmung vorhanden waren. Erst in der Größenordnung von ungefähr 0,1 mg Frischgewicht ließ sich Streckurigswachstum und Kallusbildung beobachten. In diesem Größenbereich war, wie zu erwarten, eine hohe Ausfallquote zu verzeichnen.

Damit hat sich gezeigt, daß bei Zellverbänden der Rübe von Daucus carota L. erst eine Mindestgröße der Explantate von etwa 0,4 mm Kantenlänge zu einer kräftigen Kallusbildung führt, und daß damit die Möglichkeit der Explantation von Einzelzellen, aus dem fest gefügten Verband heraus wohl ausgeschlossen werden muß. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Explantate läßt sich als allometrische Funktion der Oberfläche beschreiben.

2. Größenzunahme der Zellen

Da die Zunahme des Frischgewichtes sowohl durch reines Streckungswachstum, als auch durch Teilungswachstum möglich ist, wurden die Gewebe mikroskopisch untersucht. Es zeigte sich zunächst eine starke Vergrößerung der Zellen im gesamten Verband. Insbesondere die kambialen Zellen, die waren hiervon betroffen und zeigten nach etwa einer Woche, im inneren des Gewebes, fast ohne Teilung, eine deutliche Abrundung ihrer Form, wodurch sich die Interzellularräume vergrößerten.

Für die ausgemessenen Kambiumzellen der Rühe ergab sich im Querschnitt, in tangentialer Richtung, ein Mittelwert von 12 m, mit einem dreifachen mittleren Fehler von 1,3 m. Etwa bei 16 m teilen sich die meisten Zellen in zwei neue von 8 m. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen Zellen des Markstrahls (17,9 ± 3,5 m) und des Leitgewebes (9,5 ±1,2 m im t-Test für l % Überg,ingswahrscheinlichkeit.

Kambiumzellen strecken sich innerhalb von 11 Tagen (Dies gilt für Explantaite von ungefähr 80 mg) von 12,0 ±1,3 m auf 19,8 ± 2,8 m und weiteren 18 Tagen auf 29,4 ± 3,7 m, wobei die erwähnten Unterschiede verloren gehen.  (Leitgewebe-Region 28,5 ± 6,8 m; Markstrahl-Region 31,0 ± 10,5 m). ln dieser Zeit können sich die Zellen nicht, bzw. nur innerhalb der bestimmten Abweichungen, geteilt haben, da die relative Größenzunahme der Zellen, mit der der gesamten Explantate, identisch ist.

In radialer Richtung zeigt sich im Leitstrang der Rübe, in der Mitte des Kambiums, ein Zelldurchmesser von 6,5  ± 1,2 m, der zu den Grenzen des Kambiums hin, auf 12,4 ± 2,4 m ansteigt. Die entsprechenden Werte für die Markstrahlen sind 11,4 ± 2,9 m und 27,2 ± 4,9 m. Nach 11 Tagen sind auch in radialer Richtung keine nachweisbaren Differenzen mehr zu erkennen. In der Leitgewebe-Region wurden zu dieser Zeit 28,9 ± 8,8 m und in der Markstrahl-Region 30,4 ± 9,3 m gemessen. Damit hatten die Zellen Form und Größe des benachbarten Parenchyms. Die Dicke des Kambiums in der Rübe lag etwa bei 140 m während das entsprechende Gewebe nach 11 Tagen etwa 370 m einnahm. Es muß betont werden, daß nur im Inneren größerer Explantate die Kambiumzellen reines Streckungswachstum ohne Teilung zeigen.

Kreisförmig ausgestochene Explantate, deren Durchmesser 5 mm betrug, wurden sowohl entlang des Kambiums, als auch senkrecht dazu vermessen und zeigten eine wachsende elliptische Verformung. Dabei kam es zu starken Gewebespannungen, die sich häufig durch aufreißen der Verbände in der Kambiumregion erkennen ließen. Auch die Schnittkanten wurden in der zweiten und dritten Woche rissig und gaben so den Weg für die Kallusbildung frei (Abb. 4).


Abb, 4. Kultur auf M_SW, 20 Tage alt, Ausgangsgewicht 4,1 mg Frischgewicht, aus dem Holzteil der Rübe. Bei dieser Kultur verhinderten die abgestorbenen Zellen der Schnittkanten die oberflächliche Kallusbildung für längere Zeit.


Sobald nach einigen Tagen die Zellteilung verstärkt einsetzt, werden viele der zunächst stark vergrößerten Zellen unterteilt (Abb.5) und bilden so die Voraussetzung für die sehr kleinzelligen meristematischen Proembryonen. Dies betrifft, bei Explantanten von cirka 100 mg, vorwiegend im Inneren liegende Zellen der jungen Bastregion. Hier entstehende Zentren können nur zur Entwicklung kommen, wenn das Gewebe an den entsprechenden Stellen aufreißt. Der Durchmesser dieser Zentren beweist, daß sie nicht aus einer, sondern aus mehreren Zellen entstanden sein müssen. Sie können sich sowohl zu Wurzeln, als auch zu Embryonen entwickeln. Der Grund für die Entstehung dieser Zentren erhöhter Teilungsaktivität liegt zweifellos in der Kumulation der Baustoffe. Durch die bereits erwähnte Gewebespannung, die bei Explantaten dieser Größe auftritt, scheint der junge Bast besonders prädestiniert zu sein (Abb.8).



Abb. 5.Gewebe einer 8 Tage alten Kultur auf M_W. Die ursprüngliche Zelle des Explantates hat sich in 15 neue Zellen geteilt. Die dickwandige ursprüngliche Zellwand reagiert positiv auf Gordon-Weber's Reagenz (Nachweis auf Indolkörper). Verbände dieser Art können die Voraussetzung zu ProEmbryonen sein.


Mit zunehmendem Alter werden die Explantate immer lockerer, die Zellen immer größer und stärker abgerundet, und die Festigkeit des Gewebes immer geringer. Unterhalb der Schnittkante läßt sich meist nach 3 - 4 Tagen eine kambiumartige, morphologisch dem Korkkambium analoge, Region erkennen. Diese Zellen teilen sich nach der Streckungsphase fast ausschließlich parallel zur Schnittkante und liegen meist 2 - 3 Zellschichten von den verletzten Zellen entfernt. Die abgestorbenen Zellen der Oberfläche bilden zunächst eine optisch dichte Schicht (wahrscheinlich durch die oxidative Wirkung des Luftsauerstoffs entstandene Phlobaphene), die jedoch bald mechanisch aufgerissen wird. Aus den Zellen, die direkt an der Oberfläche liegen, ohne selbst verletzt zu sein, erwächst der Kallus durch Oberwucherung des toten Gewebes (Abb.7).


Abb. 6. Zwanzig Tage altes Explantat, auf M_W gewachsene mit einem Ausgangsgewicht von 115 mg Frischgewicht. Links zeigen junge Tracheen den Beginn des Holzteiles an. Direkt angrenzend das Kambium mit seinen stark vergrößerten Zellen. Ein Teil der parenchymatischen Zellen des Bastes haben sich direkt in Tracheiden umdifferenziert. Rechts ein teilungsaktives Zentrum, das aus vielen, kleinen meristematischen Zellen besteht und im jungen Bastgewebe eingebettet ist. Das Zentrum befindet sich etwa 500 m unterhalb der oberen Schnittkante des Explantates.


Das korkkambiumartige Meristem scheint an der Kallusbildung keinen weiteren Anteil zu haben. Sofern es nicht rhexigen neu induziert wird, bleibt es meist unveräendert.


Abb. 7. Kallusbildung einer 17 Tage alten Kultur auf M_SW gewachsen. Die abgestorbene Zellschicht des ursprünglichen Pxplantates ist deutlich mit ihren Kallusdurchbrüchen zu erkennen. Das explantierte Gewebe hatte eine Dicke von etwa 200 m und einen Radius von 2,5 mm.

3. Zellteilungsaktivität

Durch Zählung der Mitosen konnte festgestellt werden,
wie groß der prozentuale Anteil sich teilender Zellen war. Nach etwa 3 Tagen wurden meist die ersten Teilungsaktivitäten beobachtet.



Abb. 8 a-c Zellteilungsaktivität der Explantate im Laufe der Kultivierungszeit. Explantate mit
a = 6 mg; b = 60 mg ; c = 115 mg Ausgangsgewicht auf M_S kultiviert. o-o = Nach Colchicinbehandlung gezählte Mitosen. .----. =  Absolute Zellzahl der Explantate. ----- (Histogramm) Auf Grund der Zellzahl errechnete Mitosen.

 Abb. 8 d.Explantate mit 2 mg Ausgangsgewicht auf M_W kultiviert. Übrige Angaben, siehe Abb. 8 a-c .


Bei Explantaten von mehr als 50 mg fanden sich dann die Mitosen häufig im jungen Bast und im Kallus, bei kleinereri Explantaten war-en sie dagegen meist über das ganze Gewebe verteilt. In den untersuchten Fällen zeigte sich eine leichte Synchronisation (Abb. 8 a-c), die sich jedoch bald verlor.

Zur Kontrolle wurden auch die Zellzahlen bestimmt, um damit Rückschlüsse darauf ziehen zu können, wieviel Prozerit der Zellen sich in acht Stunden (den Mitosezählungen vergleichbar) in Teilung befinden.

Dabei geht man vorteilhafter weise vom Zinseszinzprinzip aus.

P  = Prozent der Teilung
Z₁ = Zellzahl bei der ersten Zählung
Z₂ = Zellzahl bei der zweiten Zählung
N = Zeit - in 8-Stunden-Einheiten.

Die sich daraus ergebenden Werte zeigen eine annähernde Obereinstimmung mit den gezählten Mitosen und erscheinen so recht zuverlässig. Auf dem gleichen Wege läßt sich auch die Teilungsrate der ersten 10 Tage ermitteln.
 

Nährmedium	Ausgangsgewicht	Teilungsrate/10 Taze
MS	6 mg	7,8 %
MS	60 mg	3,1 %
MS	115 mg	2,9 %
MW	2 mg	4,6 %

Auch bei diesen Teilungsraten läßt sich neben der Abhängigkeit vom Nährmedium die Relation zur Ausgangsgröße deutlich erkennen. Betrachtet man die Explantate von 115 mg nach 11 Tagen im Mikroskop, so verteilen sich die Zellen der Kultur zu etwa 1,54 Mio. auf den OberflächenKallus und zu 1,50 Mio. auf den zentralen Teil der Explantäte. Nimmt man an, daß nur die unmittelbar an den Schnittkanten liegenden Zellagen an der Kallusbildung beteiligt sind, so läßt sich in der Kallus-Region eine Teilungsrate von etwa 8,5% und im Zentralteil die von 1,1% berechnen.

Nach den bei Mitose-Zählungen gemachten Beobachtungen erscheint dies realistisch. Hier wird ebenfalls deutlich, welche Rolle die Oberfläche für die Entwicklung der Explantate spielt.

II Osmolalität und Saugkraft der Gewebe

1. Kryoskopische Bestimmung

Bestimmt man die osmotischen Werte des Mediums, so erhält man für M_S 150 mO und für M_W 81 mO. Diese Angaben lassen sich leicht rechnerisch überprüfen, da die Salze in der vorliegenden Konzentration fast vollständig dissoziiert sind. Demnach wäre für M_S 152,6 mO und für M_W 76,0 mO zu erwarten; auf die reine Saccharoselsg. entfallen 58,4 mO.

Es wurden 300 ml flüssiges Medium mit 300 mg Gewebe in Erlenmeyerkolben geschüttelt und in regelmäßigen Abständen untersucht. In fast allen Fällen zeigte sich in den Nährmedien ein leichter Anstieg während der ersten drei Tage und danach ein stetiger Abfall (Abb. 9). Berücksichtigt man eine Verdunstung, die sich durch stetigen Gewichtsverlust der Kulturröhrchen anzeigte, von 6% innerhalb der ersten 10 Tage und 9% innerhalb der ersten 25 Tage, so ergäbe sich, bei Abzug dieser Werte, ein minimal steilerer Abfall der Kurve. Dieser Konzentrationseffekt ist u.a. abhängig vom Abflammen der Röhrchen bei der Explantation und sollte möglichst durch gleiche Handhabung konstant gehalten werden.


Abb. 9. Veränderungen in den Osmolalitäten der Nährmedien im Laufe der Kultivierung. (n=6) o-o = Werte für M_W; .-. = Werte für M_S; D-D = Werte für 2%ige Saccharoselösung. Es ist der dreifache mittlere Fehler mit eingezeichnet.


Von der Größenordnung des anfänglichen Anstiegs her, kann es sich hier nicht nur um eine Abgabe von Substanzen aus der Kultur handeln, (sog. leaching) Fordern wahrscheinlich auch um eine teilweise Spaltung der Saccharose durch Invertase einerseits, und die bereits erwähnte Verdunstung andererseits. Darauf weisen auch die Ergebisse bei der Kultivierung in reiner Saccharoselösung hin.

Der osmotische Wert von Karotten Preßsäften ist jahreszeitlich unterschiedlich. In den hier untersuchten Fällen lagen Rüben der var. Rote Riesen mit 423±13 m0 und var. Lobbericher Futterrüben mit 400 :k 17 m0 vor. Diese Werte sind auf einen Liter Extrakt bezogen. Infolge der Explantation tritt innerhalb von zwei Wochen eine Adaptionsphase ein, in der die Kulturen je nach Medium einen erheblichen Teil ihrer osmotischen Saugkraft verlieren (Abb. 10).


Abb. 10. Veränderungen des osmotischen Wertes in den Geweben.
.-. = Kulturen auf M_S gewachsen; o-o = Kulturen auf M_W gewachsen
Die Werte beziehen sich jeweils auf einen Liter Preßsaft. Die einhüllenden Kurven geben den dreifachen mittleren Fehler an. (n=6)


Bezieht man jedoch die osmotischen Werte auf die wachsende Kultur, so zeigt sich, daß die Verluste in den ersten 10 Tagen lediglich durch die Frischgewichtszunahme bedingt und damit auf eine Wasseraufnahme zurückzuführen sind. Danach erhöht sich der absolute osmotische Wert der Kultur stetig (Abb. 11). Wir finden also auch hier zwei unterschiedliche Phasen des Kulturwachstums.


Abb. 11. Veränderunge des absoluten osmotischen Wertes der Explantate im Laufe der Kultur. Siehe dazu Abb. 10.
Sieben Jahre alte M_S-Kulturen zeigten einen Mittelwert von ungefähr 204 mO. Das bedeutet, daß die Zellen nur noch eine Differenz zum Medium von etwa 50 m0 aufrecht erhalten.

2. Grenzplasmolytische Bestimmung

Durch auszählen der plasmolysierten Zellen in verschieden konzentrierten Saccharoselösungen sollte die Grenzplasmolyse im Kambium, Bast und Holz festgestellt werden. Die erhaltenen Werte wurden als Probits aufgetragen und die Regressionsgerade ermittelt. Daraus ließ sich der Wert für die 50 %ige Plasmolyse errechnen (Abb. 12). Nach Bestimmung der 95% - Vertrauensbereiche des Mittelwertes zeigte sich im t-Test kein signifikantes Unterschied.
 
Holzparenchym 426,6 mO
Kambium 433,0 mO
Bastparenchym 428,6 mO

Abb. 12a. Unter Verwendung von Probits aufgestellte Regressionsgerade zur Ermittlung der Grenzplasmolyse. Die Streuung der Messwerte wird durch den Konfidenzintervall des Mittelwertes für g = 95% charakterisiert. Die Werte gelten für das Holzparenchym. (n = 423)

Abb. 12b. Bestimmung der Grenzplasmolyse im Kambium. (n = 387). Vergleiche hierzu Abb. 12a.

Abb. 12c. Bestimmung der Grenzplasmolyse im Bastparenchym. (n = 464). Vergleiche hierzu Abb. 14a.


Zum Vergleich der erhaltenen Werte ist die Saugkraft der Explantate bestimmt worden (Abb. 13).


Abb.13. Gewichtsveränderungen durch Einlegen von Geweben, bei der +++ Bast-, ... Holz- und ooo Kambium-Region, in unterschiedlich osmotischen Lösungen.


Als Maß wurde die Aufnahme von Wasser aus verschiedenen molalen Lösungen benutzt. Die dazu notwendige Kraft wirkt der Gewebespannung entgegen und dehnt bei Lösungen unter 400 mO bzw. 300 mO die Wände elastisch in allen drei Richtungen des Raumes aus. Nach dem "Hookeschen Gesetz"

E = S x A sollte dabei die lineare Ausdehnung E in einer der Richtungen dem Zug S und der Dehnungsgröße A direkt proportional sein. Zieht man aus den, durch Gewichtsbestimmung erhaltenen Werten die dritte Wurzel, so zeigt sich eine lineare Beziehung zwischen der Zellwandausdehnung und der osmotisch wirksamen Kraft. Die Steigungen der Geraden geben somit Auskunft über die Dehnungsgrößen (Abb. 14).
Abb. 14. Abhängigkeit der Zellwanddehnung vom osmotischen Druck. +++ Bast-, ... Holz- und ooo Kambium-Gewebe. Die Beziehung läßt sich linear gegen etwa 500 mO extrapolieren, wo die Zellwände völlig entspannt sind.


Während das Kambium und das Holz eine etwa gleiche Saugkraft besaßen, lag der Bast etwas niedriger. Der sigmoide Kurvenverlauf (Abb. 13) bei hohen Milliosmoi Werten läßt sich durch die zunehmende Plasmolyse in isotonischen Lösungen erklären. In Abb. 12 waren aus entsprechendem Grunde Probits verwendet worden.

Auf den Zellwänden der Explantate liegt bei normalem Turgor ein Druck von etwa 2 - 5 Atü. bevor sie auf das Medium gelangen. Dies ergiebt sich aus der osmolalen Differenz zwischen völlig entspannten Zellwänden, und solchen unter normaler Spannung. (Abb. 13). Die Saugkraft beträgt dagegen ungefähr 7 - 10 Atü. Bereits wenige Minuten nach der Explantation steigt das Frischgewicht bei Kulturen auf M_W um etwa 5% an, wobei der osmotische Wert entsprechend um ca.20 mO absinkt.


Abb. 15a. Sauerstoffverbrauch der Explantate, auf M_S kultiviert. Die eingezeichriete Streuungen geben den dreifachen mittleren Fehler an. (n = 6)


Ähnlich liegen die Verhältnisse für M_S - Kulturen. Die unterschiedliche Wasseraufnahme zwischen Bast einerseits und den restlichen Geweben andererseits fährt zu einer passiven Dehnung des jungen Bastes.


Abb. 15b. Kohlendioxidabgabe der Explantate, auf M_S kultiviert. Die eingezeichneten Streuungen geben den dreifachen mittleren Fehler an. (n = 6)


Durch Vakuuminfiltration wurde für die Interzellularen der frisch ausgestochenen Explantate ein durchschnittliches Volumen von etwa 0,82 % ermittelt. Die Messungen wurden in einer Saccharoselsg. von 300 mO durchgeführt, da hier der Interzellularenraum nur unwesentlich verändert wurde. So bestimmte Interzellularen sind gleichbedeutend mit dem, für den Luftsauerstoff von außen erreichbaren Raum der Explantate.

III Dissimilation der Explantate

1. O₂ - Verbrauch und CO₂ - Produktion

Verletzte Gewebe reagieren nach kurzer Zeit durch eine erhöhte Atmungsintensität der angrenzenden intakten Zellen. Dabei paßt sich das System anscheinend dem erhöhten Zustrom von Sauerstoff an.
Abb. 16 a. Sauerstoffverbr-auch der Explantate, auf M_W kultiviert. Die Streuungsbreiten geben den dreifachen mittleren Fehler an. (n = 6)


Bei der Kultivierung auf M_S erreichen die Explantate dabei etwa das Dreifache ihres Ausgangswertes (Abb. 15 a und b). Bei Kulturen auf M_W verhält es sich ähnlich (Abb. 16 a und b), jedoch mit einer zeitlichen Verzögerung.

Die benutzten Explaritate hatten eine Ausgangsgröße von 150 mg Frischgewicht und wurden direkt auf ihrem jeweiligen Nährmedium im Warburg - Apparat gemessen. Sie wurden möglichst in sterilem Zustand in die Warburg Tröge gebracht, um ohne Infektionsgefahr mehrere Stunden die Messungen fortsetzen zu können. Da es sehr wahrscheinlich ist, daß der Gasraum in den Kulturröhrchen auf Grund seiner Hydratur und seiner Gaszusammensetzung nicht nur auf das Wachstum, sondern auch auf die Atmung Einfluß nimmt, sollten durch möglichst lange Inkubationszeiten hier ähnliche Verhältnisse geschaffen werden. Zur Untersuchung auf Bakterienund Pilzbefall blieben die Kulturen noch einen weiteren Tag verschlossen stehen.


Abb. 16b. Kohlendioxidabgabe der Explantate, auf M_W kultiviert. Die Streuungsbreiten geben den dreifachen mittleren Fehler an. (n = 6)


Zum besseren Vergleich der Kulturen wurde der O₂- Verbrauch und die CO₂ - Entwicklung für jeweils ein Explantat berechnet (Abb. 17a und b). Dabei wird deutlich, daß die Frischgewichtszunahme das Kurvenbild wesentlich mitbestimmt. Das Verhältnis von O₂  zu CO₂ verschiebt sich gleich zu Beginn der Kultivierung hin zur verstärkten Abgabe von Kohlendioxid.

Zur Deckung des Sauerstoffbedarfes am zehnten Tag sind demnach etwa 11 ml Luft/24 h notwendig. Dies erfordert eine Diffusion der Gase zwischen Kulturröhrcheninhalt und Umgebung.


Abb.17a. Sauerstoffverbrauch ooo und Kohlendioxidproduktion ... eines Explantates von etwa 150 mg Ausgangsgewicht im Laufe der Kultivierung auf M_S.

2. Der Respiratorische Quotient

Beim Öffnen von Kulturröhrehen und Erlenmeyerkolben mit Geweben ist immer wieder ein sehr schwacher Geruch von Äthanol festzustellen. Dies gab Anlaß zu der Vermutung, daß die Gewebe bereits nach kurzer Zeit einen nicht unerheblichen Teil ihrer Energie aus Gärung gewinnen. Wie Abb. 18 zeigt, gilt dies für Kulturen auf M_W und M_S in gleichem Maße.
Abb. 17b. Sauerstoffverbrauch ooo und Kohlendioxidproduktion ... eines Explantates von etwa 150 mg Ausgangsgewicht im Laufe der Kultivierung auf M_W.

Abb. 18. Veränderung des Respiratorischen Quotienten bei Kultivierung auf M_W. Die Bestimmungen des dreifachen mittleren Fehlers wurde über das Gaußsehe Fehlerfortpflanzungsgesetz bestimmt.


Während frisch ausgestochene Explantate noch einen RQ von 0,9 aufweisen, liegt der RQ nach zwei Tagen bereits bei über 1. Hier dürfte in erster Linie die alkoholische Gärung der Grund sein.

Wie sich aus dem Gauß'schen Fehlerfortpflanzungsgesetz für den dreifachen mittleren Fehler ermitteln läßt, sind erst nach einer Woche die RQ-Werte signifikant höher als vor der Kultivierung.

Die Fehler für eine Übergangswahrscheinlichkeit von a = l % sind in Abb. 18 eingezeichnet.

3. Gasversorgung der Gewebe

Die Erhöhung des RQ läßt vermuten, daß der Sauerstoffpartialdruck der Zellen nicht ausreichend ist, um die notwendige Atmung zu gewährleisten. Daher wurde aus der Größe der Interzellularen die Krogh'sche Diffusionskonstante D und über die Beziehung von FENN (1927) A = Atmungsintensität
r = Radius des Zylinders (bei zylinderförmigen Geweben)
x = Abstand von der Zylinderachse
Dp = Sauerstoffpartilaldruckdifferenz

Nach BURTON (1950) ist D für O₂ in Luft



Bei 0,82 % Interzellularenanteil der Gewebe ist entsprechend:

T = Temperatur in ^o K
To = 273^o K

Setzt man für Ae die an Explantaten gemessenen Werte ein und errechnet für den Sauerstoffpartialdruck der Luft 0,21, so läßt sich die Versorgung des Gewebes mit O₂ an den verschiedenen Orten ermitteln.

Da nach KÜSTER (1955) bei einem O₂ -Anteil von weniger als 5% die Atmung in Karottengeweben abfällt, sollte Ap mit 0,16 eingesetzt werden.

Für 250 ml O₂/g.h ist



r = 2,3 [cm]

Es muß berücksichtigt werden, daß der Anteil an lnterzellularen im Kambium erheblich geringer ist (etwa 0,4%) und die Sauerstoffversorgung demzufolge örtlich abfällt. Trotzdem kann bei den Explantaten unter den gegebenen Bedingungen noch kein Sauerstoffmangel vorliegen. Nur die Beobachtung, einer im Querschnitt erscheinenden optisch dichteren Schicht auf der Oberfläche, weist darauf hin, daß hier eine Sauerstoffbarriere existiert, die je nach Hydratur im Gasraum unterschiedlich stark ausgebildet sein kann. Auch die mit der Sauerstoffelektrode gemessenen Werte von BESEMER (Diplomarbeit) die an Rüben von Daucus carota vorgenommen wurde, zeigen ebenfalls, daß Stücke mit 1,4 cm Durchmesser noch genügend 02 zur Atmung enthalten (BESEMER und KÜSTER 1965). Mit ansteigendem RQ war eine erhöhte Aktivität der Alkoholdehydrogenase und der Lactatdehydrogenase zu erwarten.

IV Aktivität und Verteilung der Enzyme in den Explantaten

1. Die Dehydrogenasen

Für die Alkoholdehydrogenase (ADH) EC 1.1.1.1 CH₃CH₂OH + NAD⁺ ----> CH₃CHO + CO₂ + NADH+H⁺ ließ sich innerhalb der ersten Woche etwa eine Verdreifachung der Aktivität feststellen.
Abb. 19. Aktivität der Alkoholdehydrogenase (ADH) in relativen Einheiten, bezogen auf das Frischgewicht der Kulturen. ooo = M_W-Kulturen; ... = M_S-Kulturen


Dies gilt sowohl für M_S-Kulturen, als auch für M_W-Kulturen (Abb. 19). Die zu erwartende Aktivitätssteigerung der ADH im Kambium, im Zusammenhang mit einer erhöhten Gärung, konnte jedoch hier nicht bestätigt werden. Vielmehr scheint bei der Kultivierung das gesamte Gewebe die Fähigkeit zur Gärung zu besitzen (Abb. 20).


Abb. 20. Aktivitätsverteilung der ADH im 5 Tage alten Explantat. Die würfelförmigen Gewebe wurden mit dem Gefriermikrotom in Scheiben zerlegt und darin jeweils die Aktivität bestimmt: ooo .
B = Bast; K = Kambium; H = Holz. Die Werte sind aus 5 Schnittserien gemittelt.


Im Vergleich dazu erhält man für die Lactatdehydrogenase (LDH) EC 1.1.1.27

L-(+)-Lactat + NAD⁺ ----->  Pyruvat + NADH+H⁺

Abb. 21. Aktivitätsverteilung der LDH im 5 Tage alten Explantat. (Erklärung siehe Abb. 20)


und die Glutamatdehydrogenase (GDH) EC 1.4.1.2

a-Ketoglutarat +NH₄⁺ + NADH+H⁺ ------>   L-(+)-Glutainat + NAD⁺ + H₂O charakteristische Profile (Abb. 21 und 22), die eine erhöhte Aktivität im jungen Bast und an den Schnittkanten vermuten lassen. Dies stimmt auch mit den Beobachtungen an histochemisch gefärbten Schnitten überein.
Abb. 22. Aktivitätsverteilung der GDH im 5 Tage alten Explantat. (Erklärung siehe Abb. 20)


Im Laufe der Kultivierung verschieben sich jedoch diese Enzymaktivitätsverteilungen so, daß nur noch an Stellen mit starkem Kalluswachstum die Aktivitäten besonders deutlich sind. Im KaMbium selbst konnte kein signifikant erhöhter Umsatz an Pyruvat, beziehungsweise Äthanol beobachtet werden. Wichtig ist, daß bereits ohne Substrat, die sog. "Nothing-Dehydrogenase", die nach ARNOLD (1968) vermutlich auf das Vorliegen von reduziertem NAD⁺ sowie NADP⁺ zurückzuführen ist, insbesondere an den Schnittkanten starke Reaktionen zeigt.

2. Die Oxidasen

Während der Kultivierung ist ein erheblicher Anstieg der Peroxidaseaktivität EC 1.11.1.7 Donor + H₂O₂ ----->  oxidierter Donor + 2H₂O zu beobachten (Abb. 23) der, wie bei fast allen untersuchten Enzymen, in M_W- und M_S-Kulturen, nach der Explantation zu beobachten ist.
Abb. 23, Aktivitätsanstieg der Peroxidase während des Kultivierungsverlaufes, in relativen Einheiten, bezogen auf das Frischgewicht der Kulturen. ++++  = M_S-Kulturen  oooo  = M_W-Kulturen


Daß die M_S-Kulturen dabei einen stärkeren Aktivitätsanstieg zeigen, ist verständlich, da hier auch die Proteinsynthese höher liegt, als bei den M_W-Kulturen.


Abb. 24. Peroxidaseaktivität in den Wänden parenchymatischer Zellen. Man beachte die ungleiche Verteilung im Bereich der Mittellamelle.


Die Lokalisation des Enzyms ließ sich sowohl in den Wänden von parenchymatischen Zellen (Abb. 24) als auch in denen von Tracheen und Tracheiden (Abb. 25) nachweisen.


Abb. 25. Peroxidaseaktivität in noch nicht voll ausgereiften Tracheen. Deutlich zeigt sich die Lokalisation in den lignifizierten Wänden.


Darüberhinaus sind eine Gruppe von Partikeln unterschiedlicher Größe deutlich anfärbbar (Abb. 26).


Abb. 26. Peroxidaseaktivität in Partikeln unterschiedlicher Größe. Die für die Bastregion typischen großen Körperchen zeigen fast immer die nur partiell vorhandene Aktivität. Die enzymatisch bedingte Farbreaktion ist meist auf die Oberfläche der sphärischen Gebilde beschränkt.


Da insbesondere die Mittellamellen bestimmter Zellen Peroxidaseaktivität zeigen, dürfte dies eine Rolle beim interzellulären Austausch von reduzierten bzw. oxidierten Substanzen spielen. Die in den Organellen enthaltenen Peroxidasen schienen in den größeren Partikeln nicht homogen verteilt zu sein. Wahrscheinlich handelte es sich dabei um einen Wachstumsprozess der Organellen, in denen durch Ablagerung der katalysierten Produkte sog. "residual bodies" mit Restaktivitäten entstanden. Die Ergebnisse durch Artefaktbildungen zu erklären scheint auf Grund der gemachten Beobachtungen als unwahrscheinlich, da sich der gebildete Farbkomplex nach einer abgeschlossenen Reaktionszeit auch kaum weiter verbreitet.

Die Cytochromoxidasen waren in den Zellen der Rübe vorwiegend im Bast aktiv (Abb.27). Hier sind die Mitochondrien zahlreich vertreten und zum Teil deutlich gefärbt. Besonders starke Färbungen sind in den Sieb- und Geleitzellen zu finden, die dem Kambium benachbart sind. Das Kambium ist trotz vieler Mitochondrien weniger auffällig beim Nachweis auf Cytochromoxidase. Während der Kultur verlieren sich diese Unterscheidungsmerkmale der Gewebe.

Siebzellen haben bei der Explantation ihre ursprüngliche Funktion eingebüßt. Inre Neubildung, und die damit verbundenen Nachweisreaktionen sind erst bei neu eintretender Morphogenese zu beobachten.


Abb. 27. Lokalisation der Cytochromoxidasen in den Siebplatten und im Plasma der Siebzellen.


Als Substrat für die Phenoloxidasen wurde sowohl Dihydroxyphenylalanin (DOPA-Oxidase) als auch Brerizcatechin erprobt. Dabei zeigte sieh die DOPA-Oxidase weder in der Rübe noch im Kallus aktiv. Dagegen konnte bei den Kulturen ein erheblicher Anstieg an umgesetztem Brenzcatechin, in Polyphenole beobachtet werden. Die Rüben zeigten nur sehr geringe Aktivität an Brenzcatechin oxidierender Phenolase. Nach zwei Tagen ließ sich in den Explantaten ein deutlicher Anstieg nachweisen, der nach etwa sechs Tagen zu einer maximalen Reaktion führte. Obwohl die Ergebnisse nicht streng quantitativ sind, zeigt sich doch auch hier deutlich, daß M_S-Kulturen um etwa 60% aktiver sind als M_W-Kulturen.


Abb. 28. Verteilung der RNAse und der sauren Phosphatase im Dichtegradienten zum Nachweis der Lysosomenfraktion. oooo = saure Phosphatase .... = RNAse. Darunter sind die Stufen des Saccharosegradienten eingezeichnet.

3. Die Phosphatasen

Als Markerenzym der Lysosomem kommt der "sauren Phosphatase" - EC 3.1.3.2 - eine besondere Bedeutung zu. Ihre Entdeckung geht auf DE DUVE (1959) zurück. Ihre Obereinstimmung, mit den von PERNER (1952) beschriebenen Sphärosomem wurde von MATILE et al. (1965) nachgewiesen. Zunächst konnte auch bei Karotten gezeigt werden, daß im Dichtegradienten zwei distinkte Fraktionen enthalten sind (Abb. 28).
Abb. 29.  Die Aktivität der "sauren Phosphatasell in relativen Einheiten.  Dazu wurde ein Würfel 5x5x5 mm mit dem Gefriermikrotom in Scheiben von 50 m zerlegt und darin jeweils die Aktivität bestimmt. oooo = Aktivität eines Schnittes; oooo und ...... = Aktivität in je zwei Schnitten.


Die Lysosomenfraktionen enthielten neben der "sauren Phosphatase" (EC 3.1.3.2) auch Ribonuclease (EC 3.1.4.22), die zu den Phosphodiesterasen gehört. Darüberhinaus waren im Sediment der 500 x g - Fraktion Aktivitäten der "sauren Phosphatase" auffindbar, die um das vierfache höher lagen, als die der 30.000 x g- Fraktion.  Hier handelte es sich nach mikroskopischen Untersuchungen vorwiegen um Bruchstücke der Zellwand. Zur Bestimmung der Lokalisation des Enzyms wurde in dünnen Schnitten d er würfelförmigen Explantate eine Aktivitätsbestimmung vorgenommen. Wie Abb. 29 zeigt tritt die Kambiumregion durch eine erhöhte Aktivität hervor. Das Profil verliert während der ersten 5 Tage der Kultur weitgehend seine Charakteristik. Daß in den Leitelementen eine höhere Aktivität zu finden ist, als in den Markstrahlen, wird in Abb. 30 verdeutlicht.


Abb. 30.  Verteilung der "sauren Phosphataseaktivität" in der Rübe. Deutlich hebt sich das Kambium und die Leitelemente durch eine erhöhte Aktivität ab.


Sowohl in der Verteilung der "sauren Phosphatase", als auch bei der der Stärke, zeigt sich vom Kambium nach außen hin eine periodische Schwankung, die sich wahrscheinlich während der Entwicklung der Rübe ausgebildet hat. Die Bedeutung der "sauren Phosphatasell für die Wand wird einerseits deutlich bei der Anlage der Tracheen und Tracheiden (Abb. 31) und anderseits bei der Bildung, beziehungsweise der Funktion von Plasmodesmen (Abb. 32 und 33.)


Abb. 31. "Saure Phosphatase" bei der Differenzierung einer Tracheidenwand. Zelle aus einer Suspensionskultur in M_W.

Abb. 32. Lokalisation der "sauren Phosphatase" in den Zellwänden der Kambiumregion. Querschnitt des Kambiums, eines 21 Tage alten Explantates auf M_W.

Abb. 33. "Saure Phosphatasen in Plasmodesmen einer parenchymatischen Zellen in einer 70 Tage alten M_S-Kultur.


Die hydrolitische Reaktion des Enzyms spielt eine erhebliche Rolle in den Protoplasten der sich entwickelnden Tracheen, in denen während und nach Ausbildung der Wandinkrusten die Degradation abläuft (Abb. 34.)


Abb. 34 "Saure Phosphatase" in einer kleinen entstehenden Trachee (Pfeil). Querschnitt der Kambiumregion einer Rübe.


Daneben kann des Öfteren auch in Kernen parenchymatischer, sowie kallöser Zellen, eine starke Spaltung der esterarti-
gen Phosphatbindungen bei pH 5 nachgewiesen werden (Abb. 35.)


Abb. 35. Zelle der Bastregion mit starker "saurer Phosphatase" Aktivität im Zellkern. 7 Tage alte M_W-Kultur.


Im allgemeinen durfte es sich hier um Auflösungserscheinungen hand - eln, wie sie auch bei Tracheen und Drüsenzellen zu beobachten sind.  Eine gesteigerte Phosphatabspaltung läßt sich auch in Sieb- und Geleitzellen erkennen. Die im wandständigen Plasma befindlichen Organellen sind deutlich erkennbar (Abb. 36).  Interessanterweise ist die geringere Aktivität in den Markstrahlen auch schon im Kambium erkennbar (Abb. 32 und 34). Daß die "saure Phosphatase" auch beim Streckungswachstum der Zellwände eine wichtige Funktion hat, ließ sich an Kalluszellen deutlich zeigen. Das Enzym akkumuliert im äußeren Teil des Plasmas, an den Stellen intensiven Wandwachstums. Daß die Wand selbst an diesen Stellen frei von aktivem Enzym ist, ließ sich durch vorherige Plasmolyse nachweisen. Dabei kann die Aktivität entweder über einen begrenzten Raum verteilt sein, oder eine größere Fläche der Zellwand markieren, bei der auch Strfckungswachstum zu beobachten ist. (Abb 36).

Im ersten Fall bilden die Kalluszellen nur kleine spitze Auswüchse (Abb. 37).


Abb. 36.  Aktivität der "sauren Phosphatase" in Sieb- und Geleitzellen der Rübe. Querschnitt der jungen Bastregion.

Abb. 37. Nachweis der "sauren Phosphatase" beim Streckungs wachstum von Kalluszellen.
Linke Zelle: Unterhalb der wachsenden Spitze zeigt sich eine Akkumulation von aktivem Enzym.
Mittlere Zelle: Links dargestellte Zelle um 90º gedreht.
Rechte Zelle: Nachweis der "sauren Phosphatase" im Plasma, nach vorheriger Plasmolyse.


Der Umsatz an gebundenen und freien Phosphaten für die Zellwand ließ sich verdeutlichen durch den Nachweis, daß auch ATPase in bzw. an den Wänden nachweisbar ist (Abb. 38).


Abb. 38. ATPase im wandnahen Plasma tracheidaler und parenchymatischer Zellen von 12 Tage alten M_W-Kulturen. Man beachte die unregelmäßige Verteilung in den parenchymatisehen Zellen, im unteren Teil des Bildes.


Wie sensibel die kompartimentierte "saure Phosphatase" auf äußere Einwirkungen, beispielweise mechanischen Druck, reagiert, zeigt ein Versuch an Epidermis von Cucurbita pepo L. (Abb. 39).


Abb. 39. "Saure Phosphatase" in der Epidermis von Cucurbita pepo L. nach mechanischer Einwirkung. Durch leichten Druck mit einer Präpariernadel auf das intakte Gewebe.und anschliessende Nachweisreaktion zeigt sich, daß an den gestauchten Stellen "saure Phosphatasell freigesetzt wird.


Weniger der Druck selbst, als vielmehr die Stauchung der tonnenförmig gewölbten Telloberfläche, scheint dabei die Wirkung in der Zellwand hervorzurufen, da die Auflagefläche der Präriernadel selbst ohne entsprechenden histocheiüischen Nachweis blieb. Damit zeigt sich eine hohe Empfindlichkeit der Zellwände für Zug-, Druck-, bzw.  Knickbeanspruchung. Es ist nicht ausgeschlossen, daß auch die benutzten Gewebe von Daucus carota L. in dieser Weise reagieren. Die Epidermiszellen von Cucurbita pepo zeichneten sich jedoch dadurch aus, daß sie vorher ohne jede mechanische Belastung von außen zur Untersuchung gelangten.

4. Die Esterasen

Bei den Esterasen zeigte sich zunächst, daß nicht alle Zellen im Verband im Stande sind -Naphthylacetat als Substrat zu spalten (Abb. 40). Außerdem ist die Aktivität auf die Zellpartikel beschränkt, von denen ein großer Teil den Sphärosomen zuzuordnen sein dürfte. In den größeren der meist sphärischen Körperchen ist die Aktivität des Enzyms bemerkenswerterweise ungleich verteilt (Abb. 41).

Der Nachweis mit Fluoresceindiacetat zeigte ebenfalls Zellen im Verband, mit verschwindend geringer Aktivität, d.h. Zellen ohne Fluoreszenz. Durch die starke Strahlenbelastung mit dem erregenden Blaulicht werden die Kompartimente bald zerstört, so daß sich nach wenigen Sekunden das gebildete Fluoreszein über das gesamte Plasma der Zelle verteilt.Dabei können sich auch die Zellen ohne Aktivität mit Fluoreszein anfärben und so zur Artefaktbildung führen.

Abb 40  Abb. 41
 

Abb. 40. Esteraseaktivität in parenchymatischen Zellen einer 28 Tage alten MW-Kultur. Die Aktivität ist auf sphärosomenartige Partikel  beschränkt, die jedoch nicht in allen Zellen zu finden ist.

Abb. 41. "Sphärosomen" mit inhomogen verteilter  Esteraseaktivität. Zellen aus einer 4 Wochen alten MW-Kultur.

V Analyse der Explantate und des Mediums

1. Stärke und Zucker

Obwohl der Stärke- und Zuckergehalt der Rüben vom Alter, dem Standort und der Lagerung abhängig ist, lassen sich während der Kultivierung deutlich Tendenzen erkennen, die durch die fortschreitende Kultivierung hervorgerufen werden. Dies zeigt die Färbung mit Lugollscher Lösung an den Explantaten (Abb. 42).

Die Stärke ist zunächst deutlich in den Leitstrangregionen akkumuliert. Während das Kambium fast stärkefrei ist, findet sich im jungen Bast der größte Teil dieses Reservestoffs, der mit wachsendem Abstand vom Kambium nach außen an Menge verliert.


Abb. 42. Verteilung der Stärke im radialen Längsschnitt der Explantate. Die Schraffuren deuten die Menge der jeweils vorhandenen Stärke an.
 Oben: Rübe (0 Tage alte Kultut)
 Mitte: 5 Tage alte Kultur Links M_W-Kulturen
 Unten: 10 Tage alte Kultur Rechts M_S-Kulturen
B = Bast- K = Kambium- H = Holzteil


Dies zeigten serienmäßige Dünnschnitte, in denen die Stärke extrahiert und quantitativ nachgewiesen wurde (Abb. 44).
Zum Vergleich illustriert dies auch Abb. 43.


Abb. 43. Stärkeverteilung in der Kambiumregion-der Rübe. Die Schraffur deutet die Menge der Stärke an. Man beachte die ungleichmäßige Verteilung im Bast, wie sie bei dessen Entwicklung entsteht.

Abb.44. Quantitative Bestimmung der Stärke aus 50 m dicken Serienschnitten im Explantat der Rübe. Es zeigt sich deutlich der hohe Anteil im jungen Bast.  B = Bast- K = Kambium- H = Holzteil.


Bereits nach 5 Tagen ist der größte Teil dieser Stärke abgebaut, als Zucker in der Nähe der Schnittkanten transportiert und dort wieder zu Stärke polymerisiert worden (Abb. 45).


Abb. 45. Quantitative Bestimmung der Stärke in einer 5 Tage alten M_S-Kultur.  Zum Vergleich siehe Abb. 44.  Man beachte den Anstieg an den Schnittkanten.


Bei Rüben mit sehr viel Stärke ist die Translokation undeutlicher und damit nur schwer zu beobachten.  Bei solchen, mit sehr wenig Stärke und meist höherem Zuckergehalt, wird oft auch der letzte Rest an Stärke im jungen Bast degradiert. Dieser Verlauf ist für M_W- und M_S-Kulturen grundsätzlich gleich, wenn auch M_S-Kulturen in ihrer Entwicklung zeitlich meist vorauseilen.

Wie Abb. 46 zeigt wird die Stärke nicht unmittelbar an der Schnittkante aufgebaut, sondern einige Zellschichten darunter. Unmittelbar über dieser stärkeführenden Schicht befinden sich normalerweise teilungsaktive Zellen, von der Funktion eines Korkkambiums. Die Menge an Stärke verändert sich im Laufe der Kultivierung.


Abb. 46. Längsschnitt durch eine 38 Tage alte Mw-Kultur. Am oberen Rand des Bildes sind Kalluszellen mit Kutinprotuberanzen zusehen. Darunter, in Höhe der alten Schnittfläche sind optisch dichte Regionen (in der Zeichnung schraffiert), die wahrscheinlich aus phlobaphenhaltigem, abgestorbenem Material bestehen. Die angrenzenden Zellreihen durften dem Korkkambium analog sein. Direkt unter den sich noch aktiv teilenden Zellen, liegen die Reserven an Stärke (schwarz eingezeichnet).

Abb. 47. Abnahme des Stärkegehalts während der Kultivierungszeit. Die Werte sind für M_W- und M_S-Kulturen zusammen auf den dreifachen mittleren -Fehler berechnet und eingezeichnet worden. Jede Stichprobe besteht aus 7 Werten.


In den meisten Fällen zeigt sich nach der Explantation eine geringe Abnahme des Stärkegehalts (Abb. 47).


Abb. 48. Veränderungen des Stärkeanteils eines Stammes, kultiviert auf .... = M_W bzw. oooo = M_S.

Abb. 49. Veränderung des Stärkegehaltes innerhalb der Kultur. Vergleiche dazu Abb. 48.


Bei Rüben mit sehr wenig Stärke kann jedoch auch eine zeitweilige Zuhnahme beobachtet werden. Zum Vergleich mit Abb. 47 sind auch Kulturen eines Stammes in der Entwicklung näher untersucht worden (Abb. 50). In diesem Falle kam es zu einer starken Abnahme des Stärkegehaltes, die bei den M_SKulturen ausgeprägter war als bei den M_W-Kulturen. Betrachtet man den absoluten Gehalt an Stärke in den Explantaten, so geht dieser Unterschied verloren (Abb. 51).

Abb. 50. a. Zeitliche Veränderung der Glucosekorizentration bei M_W-Kulturen und
b. bei M_S-Kulturen. Der dreifache mittlere Fehler ist mit eingezeichnet und wurde jeweils aus einem Stichprobenumfarig von n=5 errechnet.


Außerdem zeigt sich, daß der Gehalt an Stärke pro Explantat in der ersten Woche konstant bleibt und erst nach dieser Adaptionsphase gleichmäßig mit dem Frischgewicht zunimmt.

Bei der Translokation der Stärke entsteht zwischenzeitlich Zucker. Ein Teil dieses Zuckers liegt als Glucose vor (Abb. 50) und spielt neben einer osmotischen Wirksamkeit eine wesentliche Rolle bei der Atmung und der damit verbundenen Energieversorgung in Form von ATP. Auch hier zeigt sich ein Gipfel in der ersten Kultivierungswoche, der Anpassungsphase. Im vorliegenden Beispiel lag bei Mw-Kulturen am 10. Tag die Glucosekonzentration höher als bei M_S-Kulturen.

Bereits am Geschmack der Kulturen läßt sich erkennen, daß die meisten M_S-Kulturen ihren Zuckergehalt schneller verlieren als die M_S-Kulturen.

2. Proteine

Auf zytophotometrischem Wege wurde der Proteingehalt in Kernen bestimmt. In der Rübe ergaben sich dabei die

Mittelwerte von:

m = 0,165 für die Bastregion
m = 0,155   "   "  Kambiumregion
m = 0,146   "   "  Holzregion
in relativen Einheiten. Mit Hilfe des c² -Tests konnte nachgewiesen werden, daß die Häufigkeitsverteilung für a = l % Übergangswahrscheinlichkeit gesichert der PoissonVerteilung folgt.  Dabei ließen sich für die Proteinmittelwerte keine signifikanten Unterschiede in den drei Regionen nachweisen. (Abb. 51).  Während der Kultivierung steigt der Proteingehalt insbesondere in den Zellen, die den Schnittflächen benachbart sind, an.  Ebenso erhalten die Kerne der-Kalluszellen vergleichsweise große Mengen an Eiweiß.  Die entsprechenden Mittelwerte sind:
m = 0,545 an der oberen Schnittfläche
m = 0,439  "    "   unteren       "
m = 0,549 im Kallus.


Diese Werte liegen um etwa das Dreifache höher, als die aus der Rübe erhaltenen. (Abb. 52)

Abb. 51. Verteilung der, in relativen Einheiten bestimmten, Kernproteinwerte in der Rübe.
a. Kambium (n = 256); b. Holz (n = 271);  c. Bast (n = 349)


Die zumindest angenäherte Form einer Poisson-Verteilung, dürfte in erster Linie messtechnische Gründe haben und nur z.T. auf die reale Verteilung der Proteinmengen in den Kernen zurückzuführert sein.  Damit deutet sich auch an, daß möglicherweise Unterschiede zwischen Kambium, Holz und Bast mit einer präziseren Methode hätten deutlich gemacht werden können. Trotzdem läßt sich auch mit der hier benutzten Zytophotometrie deutlich erkennen, daß erhebliche Mengen an Material zu den Schnittkanten und zu den Kalluszellen transportiert wird.  Daß der Anteil an Histonen in diesen Kernen hoch ist, zeigten histochemische Untersuchungen, in denen die "Fast Green" Reaktion bei basischem pH in der Nähe der Schnittebene und im Kallus deutliche Färbungen zeigten (Abb. 53).


Abb. 52.  Verteilung, der in relativen Einheiten bestimmten Kernproteinwerte.
a. Obere Schnittkante einer 4-Tage alten M_S-Kultur.
b. Untere Schnittkante einer 4-Tage alten M_S-Kultur
c. Kallus einer 11-Tage alten M_S-Kultur.
(n_a = 182) (n_b  = 53) (n_c  = 237)

Abb. 53. Nachweis der Histone mit Fast Green bei pH 8 in 12 Tage alten M_S-Kultureri. Die histonreichen Zellkerne sind punktiert eingezeichnet. Die abgestorbenen Zellen sind schraffiert (s.a. Abb. 46)


Eine mögliche Abhängigkeit zwischen dem Proteingehalt und der Kerngröße war zu überprüfen. Daher wurden die Durchmesser der sphärischen Kerne ausgemessen.


Abb. 54. Verteilung der Kerne nach der Größe ihres Durchmessers. Untersucht wurde die Rübe.
a. Bast       (n = 198)
b. Holz       (n = 148)
c. Kambium (n = 134)


Zu stark zerklüftete Zellkerne mußten notgedrungen bei dieser Untersuchung vernachläßigt werden, da wiederholte Messungen and diesen Kernen zu große Fehler ergaben. Dies dürfte aber keinen entscheidenen Einfluß auf die Ergebnisse haben, da ihr Anteil nur sehr gering war. Betrachtet man die erhaltenen Verteilungen (Abb. 54), so fällt auf, daß sie nicht wie bei Abb. 51 und 52 der Poisson-Verteilung zuzuordnen sind. Der Grund hierfür liegt im wesentlichen darin , daß einerseits die Durchmesser gemessen wurden, während bei den Proteinbestimmungen anderseits die Volumina der Kerne entscheidend sind. Damit werden die Abszissen relativ zueinander verschoben. Unter der Annahme, daß die Kerne in erster Nährung sphärisch sind, lassen sich Rückschlüsse auf die Proteinkonzentrationen ziehen.


Abb. 55. Verteilung der Kerndurchmesser im 3 Wochen alten Kallus. (n = 263)
Die Mittelwerte für die Kerne der Rübe sind:
 x_B = 3,86 ± 0,08 m im Bast
 x_H = 4,64 ± 0,15 m im Holz
 x_K = 3,73 ± 0,12 m  im Kambium.


Im t-Test läßt sich zeigen, daß die Kerne der Holz-Region a = l % signifikant größer sind als die der beiden anderen Regionen. Dies bedeutet, daß die Kerne im Holzteil etwa das 1,5 fache Volumen der kambialen Zellkerne haben. Um den gleichen Betrag niedriger liegt damit die Proteinkonzentration. Für die Kalluszellen der Explantate (Abb. 57) wurde ein Mittelwert von

x_C  = 7,9 m ermittelt.
Das Volumen liegt also um das 4,5 fache über dem des Kambiums, die Proteinkonzentration in den Kernen der Kalluszellen dürfte somit sogar um 20 % niedriger liegen. Ein ZusammenhanR zwischen DNS-lund Protein-Gehalt konnte nicht festgestellt werden, da hierzu ein größeres Zahlenmaterial notwendig gewesen wäre.

3. DNS

Zunächst wurde die zytophotometrische Bestimmung der Desoxyribonukleinsäure in den Karotten-Kernen mit Hilfe der Feulgenreaktion versucht (Abb. 56),
Abb. 56. Zytophotometrische DNS Bestimmung mit Hilfe der Feulgenraktion. Die Fuchsinfärbung wurde durch die Zweiwellenlängenmethode gemessen.
(n = 272). Es wurden die Kambien von 5 Rüben untersucht. x = 8,66 3s = 0,90 Die Schiefe g₁ = 0,549. Durch die starke Streuung der Werte gelingt die Unterscheidung von 2C- und 4C- Kernen nur schwer.


Dabei ergaben sich durch zu starke Streuung der Werte, Schwierigkeiten bei der Zuordnung der 2C und 4C Kerne. Nach DANILINA, LUSS und BUTENKO (1965) sollen saure Proteine die Feulgenreaktion stören. Um dies zu untersuchen wurden die Kerne mit Papain behandelt, um so die Proteine abzubauen. Nach einer Behandlung von 30 Min. konnte jedoch noch keine Intensivierung der Nachweisreaktion beobachtet werden. Die Zellen zeigten weiterhin nur kleine schlecht meßbare Kerne (Abb. 57). Bei einstündiger Einwirkung von Papain zerfielen die Kerne in kleine tröpfchenförmige Untereinheiten und machten so den DNS-Nachweis unmöglich.


Abb. 57. Durch Feulgenreaktion gefärbte Kerne der Rübe nach einer halbstündigen Vorbehandlung mit Papain zum Abbau der Kernproteine.
Zur Hervorhebung der Kerne wurde ein Grünfilter benutzt.


Ein erheblicher Vorteil war die Benutzung der fluorometrischen Nachweisreaktion von RUCH (1966). Wie Abb. 58 zeigt, ließen sich hier deutlich 2C- und 4C-Kerne unterscheiden. Für die Kerne des Kambiums läßt sich im Kolmogorof-Smirnow-Test für die Signifikanzzahl a = l % eine Normalverteilung nachweisen. Damit kann angenommen werden,


Abb. 58. Wie Abb.56 jedoch mit Auramin O als fluorometrischem Nachweisreagenz. (n = 515)
x₂ = 8.47 ± 0,37  rel. Einh.
x₄ = 20,18 ± 0,75  "     "
Die Schiefe g₁ = 0,l für die 2C-Kerne und 0,69 für die 4C-Kerne. Es sind 81,6 % der Kerne 2C und 19,0% 4C.


daß die Kambiumzellen von 2-3 Monate gelagerten Rüben sich vorwiegend in der G₁-Phase bzw.  G₂ -Phase befinden, und daß es sich hier beim ersten Peak um 2C-Kerne handelt. Da die Schiefe im vorliegenden Fall g₁ = 0,1 beträgt, kann der Anteil an Kernen, die sich in der S-Phase befinden, nur sehr gering sein. Vergleicht man dazu die Verteilungen im Bast- und Holz-Parenchym (Abb. 59 und 60), so sind, trotzt zum Teil unterschiedlicher Kerngrößen, keine nennenswerten Unterschiede in der DNS-Verteilung zu sehen.


Abb. 59.  Fluoroinetrische Bestimmung der DNS in Kernen des Holzparenchyms aus 5 Rüben. (n = 471)
x₂ = 9,80 ± 0,38
x₄ = 2,916 ± 0,59 (in relativen Einheiten). Die Schiefe für die 2C-Kerne beträgt g₁ = 0,31. 89,2 % sind 2C-, 8,5 % sind 4C-Kerne.

Abb. 60. Wie Abb. 61, jedoch Kerne des Bastparenchyms. (n = 565)
x₂  = 9,84 ± 0,34
x₄  = 20,46 ± 0,59. Schiefe der 2C-Kerne g₁ = 0,121. 81,1 % sind 2C-, 18,2 % sind 4C-Kerne.


Bereits an den ersten 2 Tagen steigt der Anteil an 4C-Kernen im Kambium von 19 % auf 32 % (Abb. 61). Im Bast- und Holzparenchym steigt der Wert sogar von 8 % bzw. 18 % auf 71 % an (Abb.62).
 

Abb. 61. Kambium einer 2 Tage alten MS-Kultur.  Feulgenreaktion mit Auramin O.  (n = 73)  x2  = 12,46 ± 0,76 x4 =  20,95 ± 1,07 Schiefe der 2C-Kerne g1 = 0,14  66,4 % sind 2C-Kerne, 32,2 % sind 4C-Kerne.

Abb. 62. Holz- und Bastparenchym einer 2 Tage alten MS-Kultur.  (n=91)  x2  = 11,19 ± 1,15  x4  20,31 ± 0,90  Schiefe der 2C-Kernverteilung g1 = -0,044.  28,6 % sind 2C-Kerne, 71,4 % sind 4C-Kerne.

Dabei muß berücksichtigt werden, daß im Kambium die Grenzen zum Holz und zum Bast hin fließend sind und somit häufig bereits stark determinierte Zellen vorliegen. Außerdem durften insbesondere im jungen Bast Kerne mit starker Syntheseleistung zu finden sein. Diese Werte beeinflussen sicherlich das Ergebnis wie es in Abb. 61 wiedergegeben ist. Am dritten Tag der Kultivierung zeigt sich noch deutlicher, daß die Isolation aus dem Zellverband und seiner ursprünglichen Struktur zu starken Reizreaktionen fährt. Während im Kambium die 4C-Kerne durch die Mitose reduziert worden sind (Abb. 63), ist im Bast- und Holzparenchym der Anteil auf 83 % weiter gestiegen (Abb. 64).
 
 
 

Abb. 63. DNS-Verteilung im Kambium der 3 Tage alten MS-Kultur. (n = 74)  x2=12,14 ± 0,68 Schiefe der 2C-Kernverteilung  g1 = 0,41. 94,6 % sind 2C-Kerne.

Abb. 64. DNS-Verteilung  im Holz- und Bastparenchym (n = 100) x2 = 10,76 ±1,59 x4  = 19,49 ± 0,89 Schiefe der 4C-Kernverteilung g1 = 0.04. 17,0 % sind 2C-Kerne, 83,0 % sind 4C-Kerne.

Es ist wichtig in diesem Zusammenhang darauf hinzuweisen, daß die Untersuchungen zwangsläufig an inhomogenem Material gemacht werden mußten und somit nur Stichproben aus mehreren möglichen Entwicklungen zeigen. Trotzdem läßt sich deutlich erkennen, daß die Synthesephase im allgemeinen etwa 2 - 4 Tage dauert.


Abb. 65. Verteilung der Kern-DNS in 4 Tage alten M_W-Kulturen. (n = 114)
x₂ = 10,59  ± 1,24
x₄ = 20,99  ± 0,82
Schiefe der 4C-Kernverteilung g₁ = 0,375.
14,9 % sind 2C-Kerne, 70,2 % sind 4C-Kerne, 14,0 % der Kerne neigen bereits zur Polyploidie.


Diese erste Entwicklungsperiode durfte vorwiegend durch die Explantation hervorgerufen werden, und weniger vom Medium abhängig sein, da sie sich auf den Nährmedien Mw und Ms weitgehend gleicht (Abb. 65 und Abb. 66). Sowohl bei den M_W-, als auch bei den M_S-Kulturen liegt der 4C-Anteil bei ungefähr 70%.  Die damit verbundene Synchronisation geht hauptsächlich auf die Reizreaktion der Isolierung zurück.


Abb. 66. Verteilung der Kern-DNS in 4 Tage alten M_S-Kulturen. (n = 122)
x₂ = 10,96 ± 0,84
x₄ = 21,23 ± 1,07
Schiefe der 4C-Kernverteilung g₁ = 0,27. 19,7 % sind 2C-Kerne, 69,7 % sind 4C-Kerne, 9,8 % der Kerne neigen bereits zur Polyploidie.

Abb. 67. DNS-Verteilung im Kambium einer 14 Tage alten M_S-Kultur. (n=95)
x₂  = 9397 ± 0,81
x₄  = 18,12 ± 1,12
Schiefe der 2C-Kernverteilung g₁ = -0,429. 71,6 % sind 2C-Kerne, 27,4 % sind 4C-Kerne.

Abb. 68. DNS-Verteilung im Kambium von 10 Wochen alten M_W-Kulturen.
x₂ = 9,37 ± 0,83
Schiefe der 2C-Kernverteilung g₁ = -0,066. 82,3 % sind 2C-Kerne.


Untersucht man nach 14 Tagen das Kambium im Inneren des Explantates, so zeigt sich, daß hier die 2C-Kerne weitgehend stabil geblieben sind (Abb.67 und 68).


Abb. 69. Verteilung der Kern-DNS im Holzparenchym einer 14 Tage alten Ms-Kultur. (n = 107)
x₁ = 5,73 ± 0,59
x₂  = 10,58  ± 0,70
Etwa 24,3 % der Kerne liegen unter dem 2C-Niveau, 46,7 % sind 2C-Kerne, 17,8 % sind 4C-Kerne und 4,7 % können 8C-Kernen zugeordnet werden.


Ein Teil von ihnen durfte sogar durch Degradation geringere DNSWerte aufweisen, da die Verteilung bis in die "IC-Region" hineinreicht und in dieser Zeit auch schon Kerne mit hoher Aktivität an "saurer Phosphatase" beobachtet wurden. Das Holzparenchym zeigt einerseits diese Degradation ebenfalls, während in anderen Zellen dieses Gewebes starke Tendenzen zur Polyploidisierung zu beobachten sind (Abb. 69). Bis zu 8C-Kernen reichte die Variationsbreite der Ms-Kulturen, bei denen auch Zellen aus der Nähe der Schnittkanten berücksichtigt wurden.

Ein noch deutlicheres Bild der Polyploidisierung ergab sich für den Kallus der 14 Tage alten Explantate (Abb.70), hier wurden sogar zu 1,3 % 16C-Kerne gefunden und eine Schiefe von  g₁ =  1,002 für die 2C-Kerne.


Abb. 70.  Verteilung der Kern-DNS im Kallus von 14 Tage alten M_S-Kulturen.
(n=151)
x₂ = 10,62 ± 0,374
x₄ = 22,6  ± 1,38
x₈ =  47,58  ± 1,44
Schiefe der 2C-Kernverteilung  g₁ = 1,002. 31 % sind 2C-Kerne, 56 % sind 4C-Kerne, 12 % sind 8C-Kerne. Darüberhinaus wurden sogar zwei 16C-Kerne gemessen.


Bei den gesamten hier benutzten Explantaten von etwa 100 mg Ausgangsgewicht war noch nach 10 Wochen Kultivierung das der Rübe entnommene Gewebe zu erkennen. In diesen inneren Zellen, die oft leicht bräunlich sind, ist ein erheblicher Anteil an Kernen, die unterhalb der 2C-Zuordnung liegen (Abb. 71). Teilungen wurden hier



Abb. 71.  Verteilung der Kern-DNS in den inneren Zellen von 10 Wochen alten M_W-Kulturen.  (n = 312).  x = 8,08  ±0.53

Abb. 72.  Verteilung der Kern-DNS  in "Zentren" von 10 Wochen alten M_W-Kulturen. (n = 93). x₂  = 9,68 ± 0,37; 95,7 % sind 2C-Kerne.

Abb. 73.  Verteilung der Kern-DNS in Embryonen aus 10 Wochen alten M_S-Kulturen. (n = 120).  x₂ = 10,00 ± 0,46; 95,8 % sind 2C-Kerne.


fast nie beobachtet. Sogenannte "Zentren", die bei den M_W-Kulturen die Voraussetzung zur Wurzelbildung darstellen, zeigten einheitlichen 2C-Charakter (Abb. 72). Das gleiche gilt für die Embryonen bzw. Proembryonen der M_S-Kulturen (Abb. 73). Die Polyploidisierung spielte hier keine Rolle. Der berechnete Exzeß der Verteilung von g2 =  4,22 ist erstaunlich hoch und zwingt zu der Annahme, daß die Zellen zum untersuchten Zeitpunkt in der G1- Phase akkumuliert gewesen sein müssen.  Möglicherweise befanden sie sich gerade in einer Kultivierungsphase, die eine weitere Entwicklung behindert,e. Hierbei kann sowohl der Einfluß von 2,4-D als auch die Übertragung auf frische Nährmedien eine Rolle spielen. Um zu prüfen, ob zwischen der Polyploidisierung und der Embryogenese ein sichtbarer Zusammenhang besteht, wurden auch Zellen untersucht, die bereits seit längerem ihre Embryogenese eingestellt hatten. In der benutzten Suspensionskultur waren 13 % der Kerne bereits in einem 32C-Stadium (Abb. 74). Auffällig war auch der Anteil von etwa 4,5 % zweikerniger Zellen. Nur ungefähr 9 % der Kerne lagen im 2C-Bereich.


Abb. 74. DNU-Verteilung einer 2 Jahre alten M_S-Suspensionskultur, die keine Embryonen mehr bildet. (n = 197)
9,1 % sind 2C-Kerne, 22,3 % sind 4C-Kerne 25,4 % sind 8CKerne, 25,9 % sind 16C-Kerne und 13,2 % sind 32C-Kerne.

4. Eisenionen

Der Gehalt an Eisen-3-Ionen ist im Gewebe der Rübe vorwiegend auf die Leitstränge und das Kambium beschränkt (Abb. 75). Das Aufreten im Kambium dürfte mit der Zellteilungsaktivität dieser Gewebe Zusammenhängen. Während der Kultivierung tritt eine Translokation der Eisenionen zu den Zellen mit erhöhter meristematischer Aktivität ein.
Abb. 75. Lokalisation der Eisen3-Ionen in der Kambiumregion der Rübe und in den 5 Tage alten Explantaten. Links M_S- und rechts M_W-Kultur. Unten jeweils Schnitte senkrecht zum Kambium (Radialschnitt). Die eingezeichneten Graustufen geben die Intensität der Berlinerblaureaktion wieder.


Über diese, bei der Zellteilung anscheinend wichtige Rolle hinaus, sind die Fe⁺⁺⁺-Ionen in den entstehenden Tracheen und Tracheiden nachweisbar. Sie sind in den jungen Gefäßen akkumuliert und damit auch ein Zeichen für die Differenzierungsvorgänge bei der Embryogenese. Abb. 76 zeigt in einem'quergeschnittenen Embryo einen Kranz von Tracheen mit deutlicher Anreicherurig von Eisen-3-Ionen. Bevor es noch zur Wandverstärkung kommt, sind in den entstehenden Tracheen häufig Eisen-2-Ionen nachweisbar. Da jedoch das entstehende Turnbull's-Blau leicht abdiffundierte, war die Erscheinung, daß meist die Zellwände gefärbt waren, nicht ausreichend für eine genaue Lokalisation. Im Laufe der Tracheenentwicklung scheinen die Fe⁺⁺-Ionen früher oder später zu Fe⁺⁺⁺-Ionen oxydiert zu werden.


Abb. 76.  Eisen-3-Nachweis in den Leitbündeln eines quergeschnittenen Embryos. Ausschnitt aus dem Kranz  von Leitbündeln.

Abb. 77.  Eisen-2-Nachweis in einer jungen Trachee. Das noch vorhandene Plasma zeigt deutlich die Turnbull's Blau Reaktion.
Durch die 5%ige Salzsäure, in der sich die Schnitte bei der Färbung befinden, werden die Konturen der Zellen zerstört.


Doch können auch noch die jungen Tracheen mit bereits ausgebildeter Wandverstärkung noch Eisen-2-Ionen enthalten (Abb. 77). Verfolgt man den Verbrauch, der in den Medien enthaltenen Eisenionen, so zeigt sich zunächst, daß das gesamte Eisen2-Sulfat in den M_S-Medien während der Autoklavierung zu Fe⁺⁺⁺ oxydiert wird. Die somit enthaltene Menge von etwa 1 mM Fe⁺⁺⁺ / 10 ml Medium kann anscheinend nur zu 25 % von den Kulturen in 20 Tagen genutzt werden (Abb. 78). Im Vergleich hierzu ist jedoch das Angebot an Eisen-3-Ionen in den M_W-Medien mit 0,065 mM / 10 ml Medium annähernd vernachlässigbar gering.  Bereits das Schneiden mit dem Skalpell bringt die Explantate mit vergleichbaren Mengen an Eisen-3-Ionen durch Abrieb in Berührung.


Abb. 78.  Veränderung der Eisen-3-Konzentration im M_S-Medium während der Kultivierungszeit.

5. Ascorbinsäure

Der Gehalt an Ascorbinsäure steigt in den Explantaten während der ersten 5 Tage sowohl in M_W- als auch in M_S-Kulturen um das 2 - 3 fache an und stellt sich dann auf einen Wert ein, dessen Höhe vom Medium abhängig ist (Abb. 79a und b). Die Adaptionsphase beträgt auch hier ungefähr 10 Tage, das leichte Absinken bei den M_S-Kulturen nach dem 20ten Tag dürfte in einer Erschöpfung des Mediums liegen. Die am 28. Tag erreichten Werte sind nach dem t-Test, für die Übergangswarscheinlichkeit a = 5 % signifikant höher, als die in der Rübe ermittelten Werte. Damit zeigt sich auch hier ein erhöhtes Reduktionspotential der Explantate. Die absolute Menge an reduziertem Ascorbin, die die Gewebe produzieren, zeigt sich in Abb. 80. Mit dem erhöhten Wachstum der M_S-Kulturen geht ein erhöhter Gehalt an Vitamin C einher.
Abb. 79. Zeitliche Veränderung der Ascorhinsäurekonzentration in a. M_W-Kulturen und b. M_S-Kulturen. Die einhüllenden Kurven geben den dreifachen mittleren Fehler an.

Abb. 80.  Absolute Menge der Explantate an Ascorbinsäure im Verlauf der Kultivierung.  M_W-Kultur oooo M_S-Kultur.

6. Karotinoide

Die hier untersuchte Rohkarotinoid-Fraktion besteht vorwiegend aus ß-Karotin. Nach KUHN und LEDERER (1931) liegt der a-Karotin Anteil bei 10-20% und der g-Karotin Anteil bei nur 0,1 % in den Karotten. In der vorliegenden Untersuchung konnte nachgewiesen werden, daß keine nennenswerten Mengen an Karotinoiden in den explantierten Geweben de novo gebildet werden, beziehungsweise, daß ein möglicher Aufbau an Karotinoiden in den explantierten Geweben einem gleich hohen Abbau entspricht. Dabei läßt sich im Mikroskop deutlich die "Korrosion" der charakteristischen Prismen beobachten. Wie die folgende Tabelle zeigt, deckt sich die prozentuale Abnahme an Karotinoiden während der Kultivierung mit der prozentualen Zunahme an Frischgewicht. Im c²-Test läßt sich zeigen, daß die geringfügigen Unterschiede im Rahmen der Streuung liegen.

Die Rüben der Sorte "Rote Riesen" enthielten im Durchschnitt 8,24 mg Rohkarotin/100 g Frischgewicht.

Tage  % Abnahme an Rohkarotin  % Zunahme an Frischgewicht

0 0 0

MS 5 206 200

MW 11 243 230

MS 16 524 494

MW 21 561 560

MS 30 773 785

c^{2 =} 0,727     (nicht signifikant)

Das bedeutet, daß die Konzentration an Karotinoiden mit dem Zuwachs an Frischgewicht abnimmt.

7. Wasserstoffionen

Bestimmt man den pH-Wert in den Kulturmedien im Laufe der Kultivierung eines Stammes, so zeigen sich deutlich Unterschiede, die auf eine Beeinflussung der Explantate hindeuten (Abb. 81). Wiederholt man jedoch diesen Versuch mit verschiedenen Stämmen, so zeigt sich nicht selten eine starke Abhängigkeit von den jeweils benutzten Rüben. Der Grund liegt hauptsächlich in der geringen Pufferwirkung der Nährmedien (Abb. 82).  So verschob sich beim Autoklavieren von M_S-Medien, ohne Eisen-2-Ionen der pH weniger stark zum sauren Milieu hin, als bei der normalen Zugabe von 0,1 mM Eisen-2-Sulfat. Bei den M_W-Medien, mit der noch geringeren Osmolalität ist die Pufferwirkung noch schwächer, als bei den M_S-Medien. Die Veränderung der Pufferkapazität während der Kultivierung
ist auf den Verbrauch von Salzen zurückzuführen (Abb. 82, S. 87).
Abb. 81. pH-Verschiebungen im Medium oooo = M_W und oooo = M_S, mit Angabe des dreifachen mittleren Fehlers.
Es wurde die Entwicklung eines Stammes verfolgt. (n = 10)


Dies steht im Einklang mit den Befunden in Abb. 83, daß die Explantatextrakte im Verlauf der Kultur, je nach dem Medium auf dem sie wachsen, mehr oder weniger an Pufferkapazität einbüßen, da mit der Ionenaufnahme einerseits eine erhebliche Wasseraufnahme einhergeht, und andererseits die Ionen zum Teil in osmotisch- und pH- unwirksam Makromoleküle eingebaut werden.  Da das M_S-Medium 60 mM Stickstoff in Form von Nitrat und Ammonium enthält, haben diese Ionen neben ihrer Rolle im Proteinstoffwechsel auch eine große Bedeutung für den pH-Wert. Von Explantaten mit 115 mg Ausgangsgewicht werden etwa 2,0 ng N in 4 Wochen dem Medium entzogen. Das sind 37 % des gesamten Stickstoffangebotes. Bei M_W-Medien, mit 3,2 mM Stickstoffgehalt, liegt die entsprechende Ausbeute bei 71 % in 4 Wochen. Wie die Abb. 84 zeigt, werden aus dem Medium bei Belegung mit einem beziehungsweise 2 Explantaten a 60 mg etwa 21 % bzw. 39 % des NH₄⁺-Stickstoffs in vier Wochen aufgenommen. Bei den M_S-Kulturen ist die Aufnahme von Stickstoff aus Ammonium und Nitrat etwa gleich groß. Damit ist eine erhebliche pH-Verschiebung nicht zu erwarten.



Abb. 82. Titratioriskurven von [][][][] = M_W-Medium; .... = M_S-Medium, oooo = M_S-Medium nach 2 Wochen Kultur und ++++ = M_S-Medium nach vier Wochen Kultur.

Abb. 83. Titrationskurven von Extrakten der Rübe - - - -, von 14 Tage alten M_S-Kulturen ++++ und von 14 Tage alten M_W -Kulturen oooo.  Zum Vergleich sind auch die Titrationskurven der Medien M_S = s und M_W = w eingetragen.

Abb. 84. Abnahme des ammoniakalischen Stickstoffs in den M_S-Medien während der Kultivierung. oooo = Medien mit je 2 Explantaten à 60 mg Frischgewicht / Kulturröhrchen belegt. DDD = Medien mit je 1 Explantat à 60 mg Frischgewicht / Kulturröhrehen belegt.


Bei M_W-Kulturen, bei denen das Angebot an Stickstoff auf 0,45 mg pro Röhrchen beschränkt ist, kann nur Nitrat aufgenommen werden.

VI Histologische Untersuchungen

Explantate, mit einer Dicke von nur wenigen Zelldurchmessern, zeigten einen hohen Anteil an verletzten Zellen und damit oft nur geringe Wachstumsfähigkeit. Hier ist eine untere kritische Grenze erreicht, bei der, wie in Abb. 85a alle Zellen zu stark verletzt oder geschädigt waren, um noch lebensfähige Explantate zu erhalten. Abb. 85 b zeigt dagegen eine ebenso dickes Explantat mit reger Teilung. Der Grund liegt darin, daß die Zellen in Abb. 85b in der Nähe der Tracheen etwas kleiner sind, und damit bei der Explantation mehr unverletzte Zellen vorlagen. Die eigentliche Kallusbildung, außerhalb der Schnittkante, begann erst nach etwa zwei Wochen (Abb. 85c). Die Voraussetzung für diese Entwicklung ist neben einer ausreichenden Versorgung der Zellen, ihre räumliche Entfaltungsmöglichkeit.
Abb. 85a. 10 Tage alte M_S-Kultur, deren Dicke bei der Explantation etwa 100 m betrug. Die Holzparenchymzellen sind fast alle nach ein bis zwei Teilungen abgestorben.
 
Abb. 85 b. 10 Tage alte M_S-Kultur wie in Abb. 85a. Jedoch haben sich die etwas kleineren, die Tracheen umgebenden Zellen, aktiv geteilt. Man erkennt noch die Konturen der ursprünglichen Parenchymzellen.

Abb. 85c. 17 Tage alte M_S-Kultur wie in Abb. 76a. Neben einer regen Zellteilung im ursprünglichen Gewebe zeigt sich nun auch eine ausgeprägte Kallusbildung.


Wie sich durch wiederholtes Ausmessen der Zellen und der gesamten Explantate berechnen ließ ist im Inneren größerer Explantate das Kambium nur in der Lage Streckungswachstum durchzufüheren (Abb. 86). Die Zellen verlieren dabei ihre Polarität und runden sich ab, was zu einer starken Erhöhung des Interzellularraumes führt.


Abb. 86. Kambium einer 18 Tage alten M_S-Kultur von etwa 100 mg Ausgangsgewicht. Die Zellen haben sich durch reines Strekkungswachstum abgerundet und dabei große Interzellularen gebildet. Die Markstrahlzellen vergrößern sich stärker, als die des faszikulären Kambiums. Die Tracheen erscheinen schwarz.


Damit wird der Gasaustausch erheblich erleichtert.  Besonders deutlich wird dies bei den Markstrahlzellen.  Die kambialen Zellen gehen häufig in Tracheiden über, insbesondere kurz unterhalb der Schnittkante (Abb. 87).


Abb. 87. 14 Tage alte M_W-Kultur mit längs geschnittenen Tracheen Links neben den Tracheen haben sich ursprüngliche Kambiumzellen direkt in Tracheiden umgebildet. Oberhalb der Tracheiden hat sich ein Korkkambium ausgebildet. Das Ausgangsgewicht des Explantates betrug etwa 100 mg.


Bei Explantaten mit über 100 mg Frischgewicht kann man die Neigung zur Tracheidenbildung gut studieren. Hier zeigt sich, daß insbesondere die Kambiumzellen, die zum Phloem hin abgeteilt werden, besonders günstige Determinationsvoraussetzungen bieten (Abb. 88).


Kambium    Bast
Abb. 88. 20 Tage alte M_S-Kultur. Tracheen längs geschnitten (im Bild ganz links). Weite Teile des Kambiums sind in Tracheiden differenziert worden.
Der Markstrahl wird von Tracheiden teilweise umhüllt.
 

Abb, 89. Kambiumzellen aus einer 3 Woch.en altenMW-Kultur' die sich in Tracheiden umdifferenzierän. Dabei nimmt die Anzahl und Größe der Sphärosomen zu. Die Zellen sind längs-radial geschnitten. a. Zellen etwa 300 m unterhalb der Schnittkante. Rechts im Bild eine angeschnittene Tracheide, die aus einer Kambiumzelle entstand. b. Zellen etwa 600 m unterhalb. der Schnittkant. c. Zellen etwa 1 mm unterhalb der Schnittkante. d. Zelign etwa 1,5 mm unterhalb der Schnittkante. Hier beginnt die Entwicklung der "lysosomenartigen Partikel".

In manchen Fällen konnte beobachtet werden, daß sich das gesamte Kambiujn direkt in einen Tracheidenverband umwandelte. Diese Entwicklung läßt sichan dem verstärkten Auftreten von "lysosomenartig en Partikeln", die im fortgeschrittenen Zustand als Sphär.osomen anzusehen sind) erkennen. Damit scheinen die Lysosomen eine wichtige Rolle bei der Degradation des Protoplasmas in der Tracheidenentwicklung zu spielen, wobei sie selbst in die sog. "residual bodies" übergehen. Diese "residual bodies" müssen demnach den in der Botanik seit längerem bekannten Sphärosomen Perner's gleichgesetzt werden (Abb. 89).

Auch die Zentren hoher Teilungsaktivität enthalten bei der Wurzelbildung großlumige Zellen, mit einer erhöhten Zahl an Sphärosomen, die zur Bileung eines zentralen Leitbündels fuhren (Abb. 90).


Abb. 90. 20 Tage alte M_W-Kultur, die zur Wurzelbildung ein teillungsaktives Zentrum ausgebildet hat. In der Mitte bilden sich aus großlumigen,
sphärosomenreichen Zellen (Pfeil) die Leitelemente.


Explantate, mit über 100 mg Ausgangsgewicht, zeigten auf M_S-Medium neben der Fähigkeit Embryonen zu bilden, auch die Genese von Wurzeln. Wie aus Abb. 91 ersichtlich ist, können aus solchen Wurzeln auch neue Proembryonen entstehen. Wurzeln und Embryonen unterscheiden sich unteranderem histologisch in der Anlage der Leitbündeln und damit wesentlich durch die Differenzierung der Tracheen.


Abb. 91 Wurzel und Einbryonen aus einer 52 Tage alten M_S-Kultur. Das ursprüngliche Explantat von 115 mg Ausgangsgewicht brachte sowohl Wurzeln als auch Embryonen hervor. Hier entstehen aus einem Zentrum nebeneinander beide Differenzierungsprodukte.


Alle untersuchten Embryonen zeigten verwachsene Keimblätter, wie sie auch bei 2,4-D-behandelteh Samen typisch sind. In der Regel ist der Sproßpol trichterförmig ausgebildet (Abb. 92). Bei der Entwicklung der Embryoenen


Abb. 92. Längsschnitt durch einen Embryo aus einer 11 Wochen alten M_S-Kultur. Die Kotyledonen sind ringförmig verwachsen, die Leitbündel folgen im Sproßteil dieser ringförmigen Anordnung.


wurden im Gegensatz zur Wurzelbildung zunächst scharf begrenzte kugelförmige Komplexe teilungsaktiver Zentren beobachtet, die bei Erreichung des herzförmigen Stadiums am Wurzelpol einen Zentralzylinder und am Sproßpol eine ringförmige Anlage von Leitsträngen differenzierten.

Explantate von 150 mg Frischgewicht, in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben mit 50 ml Medium, enthielten noch nach 9 Monaten, ohne Übertragung im Dunkelraum bei 28° C gehalten, etwa 18 % lebende Kalluszelleh mit Plasmaströmung. Die Explantate waren nur die ersten 4 Wochen geschüttelt worden. In diesen Erlenmeyerkolben mit M_S-Medium gab es Zellen mit hoher Aktivität an "saurer Phosphatase" und solche, die fast völlig aufgelöst waren. Daneben differenzierten sich noch Zellen in Tracheiden um.

Erster Hinweis dafür sind die charakteristischen Plasmaströmungsmuster, die bereits den Verlauf der späteren Wandverdickungen erkennen lassen.

Reine Suspensionskulturen blieben dagegen bei weitem nicht so lange ohne Obertragung am Leben, da diese Zellen alle in einem sehr ähnlichen Zustand sind, und sich z.T. sogar synchron entwickeln. Hier ist die Möglichkeit, daß sich ein Teil der Zellen am Leben erhält, während ein anderer Teil abstirbt, unwahrscheinlich - die Zellen sterben etwa zur gleichen Zeit.
 

Diskussion

Zu Beginn dieses Jahrhunderts vertrat man bereits die Ansicht, daß die physiologische Arbeitsteilung zu einer morphologischen Differenzierung in den höher entwickelten Lebewesen führt. Dabei spielt nach HABERLANDT (1914), sowohl das "mechanische Prinzip" als auch die Korrelation der Gewebe, die in harmonischer Weise kooperieren müssen eine fundamentale Rollei Dieser Umstand, auf den wohl als erster ROUX (1881) in seiner Abhandlung "Kampf der Theile im Organismus" bezug nahm, und der ebenfalls von SACHS (1874), PFEFFER (1904) und JOST (1923) in entsprechender Weise diskutiert wurde, läßt sich heute auf Grund der Möglichkeiten, bei der Kultivierung von Zellverbänden, weitgehend analysieren.  So zeigt sich hier, wieweit die Stabilität einer differenzierten Struktur verändert bzw. aufgehoben werden kann. In Verbindung mit einer solchen Strukturveränderung wird ebenfalls die Spezialisierung der Zellen, die eine Voraussetzung für die Arbeitsteilung ist, verändert.  Differenzierung ist häufig, insbesondere in der tierphysiologischen Literatur, als ein stabiler Zustand definiert, obwohl die Stabilität einer Struktur von einer Zelle zur anderen stark schwankt (GOSS 1964). Eine typische Erscheinung dafür ist die Metaplasie, bei der die Zellen über Dedifferenzierung zu einem neuen Typ transferieren.

HABERLANDT (1925) vertrat die Ansicht, daß die Zelle als Elementarorgan durch Wechselbeziehungen spezialisiert ist, eine Auffassung, die auch schon VÖCHTING (1868) in ähnlicher Weise zum Ausdruck brachte. VÖCHTING gelangte auf Grund seiner Versuche mit Zweigen von Salix viminalis, Wurzelstücken von Populus pyramidalis und Blattsegmenten von Begonia rex zu dem Schluß: "daß keine vegetative Zelle am Pflanzenkörper eine spezifische und unveränderliche Energie besitzt, sondern daß ihre Funktion bestimmt wird durch das physiologische Individiuum, von dem sie einen Teil bildet. - Und zwar ist es in erster Linie der Ort an der Lebenseinheit, welcher die Funktion der Zelle bestimmt". Dies gilt insbesondere füt, so stabile Systeme wie den Seitensproß zweiter Ordnung bei Araucaria excelsa, der die sog. Topophysis (MOLISCH 1916) zeigt. Interessant ist, daß bei diesen, auch als Steckling plagiotrop wachsenden Seitensprossen, die adventiv gebildeten Wurzeln, wieder die Fähigkeit zum positiv geotropen Wachstum besitzen. Während also die Zellen an sich ihre Totipotenz behalten haben, zeigen sie im Verband eine stabile Determination.

Dieser kurze Rückblick macht deutlich, daß zumindest im pflanzenphysiologischen Bereich seit langem Anhaltspunkte dafür existieren, daß Differenzierung zum einen, an die Arbeitsteilung der Gewebe geknöpft ist, zum anderen an die jeweilige Situation in der sich die Zellen befinden. Von einer permanenten Differenzierung im Sinne von WEISS (1949) kann also nur in extremen Fällen gesprochen werden, wie z.B. bei der Entstehung von Holzfasern und Tracheen, die beispielsweise in einem "programmierten Zelltod" ein Stadium der irreversiblen Differenzierung erreichen. Nach TOPONI (1961) und PAUPARDIN (1964) ist aber diese Entwicklung noch im Stadium der charakteristischen Wandbildung umkehrbar. Nach GAUTHERET (1966) soll jedoch von den lignifizierten Zellen nur das parenchymatische Stadium erreichbar sein.  Von den parenchymatischen-, sekretorischen- und Geleitzellen soll jedoch auch das meristematische Stadium erreicht werden können. Demnach müßte eine Trachee allerdings über das parenchymatische, bis zum kambialen Stadium hin dedifferenzierbar sein. Dies stimmt mit eigenen Beobachtungen insoweit überein, als das Zytoplasma und der Zellkern in den Tracheen und Tracheiden erst degradiert werden, nachdem die Akkrustierung abgeschlossen ist. PHILLIPS und TORREY (1974) fanden in Tracheen einen DNS Gehalt, der ihrer Meinung nach "undifferenzierten" Zellen glich. Bis zu diesem Stadium nur von Modifikation zu sprechen, scheint insofern nicht gerechtfertigt , als hier eindeutig eine Spezialisierung vorliegt. Damit kann aber die Stabilität auch kein ausreichendes Kriterium für die Differenzierung sein.  Anderseits ist die molekularbiologische Vorstellung von NEUMANN, SCHÄFER und BLASCHKE (1975), unter Differenzierung einen Vorgang zu verstehen, "durch den Zellen identischen genetischen Informationsgehaltes, mit unterschiedlichen Proteinarten und damit Enzymen ausgestattet werden", nicht nur für differenzierte sondern auch für modifizierte Zellen zutreffend.

Folgt man dagegen der Definition, daß Differenzierung immer an Arbeitsteilung gebunden sein muß, so entsteht die grundsätzliche Frage welche Zellen in einem Organismus spezielle Aufgaben übernehmen.  Selbstverständlich kann in der Epigenese eine Zelle auch unterschiedliche Spezialisierungen durchlaufen, die aber immer von den zufälligen Modifikationen unterschieden werden müssen. Die epigenetische Entwicklung zeigt sich deutlich am Beispiel der Tracheenentstehung, bei der neben der Funktion als Festigungselement nach SHELDRAKE und NORTHCOTE (1968) auch die Entstehung von Phytohormonen für den Organismus eine Rolle spielt, und die nach dieser Phase für den Wasserhaushalt unentbehrlich werden. Aus dieser Betrachtungsweise heraus ist es einsichtig, daß in der Epigenese bestimmte Stufen durchlaufen werden müssen, die wir auch als Determinationsphasen bezeichnen können.

Bei der Dedifferenzierung ist entscheidend ob es sich einerseits um irreversibel oder reversibel-differenzierte Zellen handelt und anderseits, ob die Zellen eine modifikatorische Differenzierung oder eine differentielle Zellteilung im Sinne HOLTZER'S hinter sich haben. Der Terminus "modifikatorische Differenzierung" ist insofern ungünstig, da Zellen gleicher Funktion, wie z.B. Speicherparenchyme, aber unterschiedlicher Situation, d.h. mit schwankendem Stärkegehalt, als Zellen unterschiedlicher Modifikation, nicht aber als Zellen unterschiedlicher Differenzierung angesprochen werden müssen. Es wäre daher treffender von einer topophysischen Differenzierung zu sprechen. Dieser Begriff soll auf die "Ortsnatur" (MOLISCH 1916) der Zellen hindeuten.

Ein wesentliches Element der Differenzierung ist die Selbstregulation (ROUX 1881 und PFEFFER 1894) der Organismen. Sie muß das System, sofern es stabil ist, an äußere Einflüsse mit einer ausreichend hohen Geschwindigkeit anpassen.  Solche Einflüsse extremer Art sind beispielsweise die Transplantationen von Zellverbänden.  Ihnen folgen, bis zur e-Funktion hin gedämpfte Schwingungserscheinungen in der physiologischen Rückkoppelung der Systeme. Dies zeigte sich beim Gasaustausch, bei den osmotischen Verhältnissen und bei den enzymätischen Aktivitäten. Entsprechende Anpassungsvorgänge finden sich beim Stärkegehalt und bei der Ascorbinsäurekonzentration, die sich durch unterschiedliche Dämpfung, d.h. durch mehr oder minder straffe Rückkopplung auszeichnen.  Es ist naheliegend, daß ungedämpfte Schwingungen nicht zu erwarten sind, da sie zur Eskalation und somit zum Absterben der Gewebe führen würden. Die Dauer der Dämpfung ist allgemein annähernd eine Woche, danach geht das System in einen adaptierten, inetwa linearen Zustand über, solange keine neuen abrupten Veränderungen auftreten. Dies spricht für ein feedback innerhalb der Gewebe, dessen Übertragungsgeschwindigkeit, wahrscheinlich bei einigen bis mehreren Stunden liegt.

Hier deutet sich ein weiteres Problem bei der Differenzierung an: Die Differenzierungen innerhalb einer Zelle und die innerhalb eines Organismus sind klar zu unterscheiden. Sowohl die Diffusionsstrecken als auch die Zeiten für die Informationsübertragung sind im interzellulären System völlig andere als im intrazellulären. Trotzdem wiederholt sich das Prinzip der Arbeitsteilung und damit das der Differenzierung in Organe bzw. Organellen.

Eine der wichtigsten selbstregulatorischen Erscheinungen ist das korrelative Wachstum der Gewebe, das sich formal in der allometrischen Beziehung deutlich macht.  Verändert man die Situation eines Zellverbandes durch Explantation abrupt, so zeigt sich im Anstieg des Frischgewichtes eine Volumenzunahme der Zellen, die von der Größe (CAPLIN 1963) bzw. von der Oberfläche der Explantate abhängig ist. Die Gewebe können durch ihren hypertonischen Zustand sofort Wasser aufnehmen und gehen direkt Über die elastische und plastische Dehnung in den Wachstumszustand über. Dies gilt jedoch nur für Medien, die 2,4-D enthalten. Eine lag-Phase kann hier nicht beobachtet werden, und legt den Vergleich mit den Versuchen von NISSL und ZENK (1969) nahe.

Bei dem, durch die Oberfläche limitierten Wachstum, wird das "mechanische Prinzip" HABERLANDTIS deutlich, daß bei der Morphogenese der Gewebe eine Rolle spielen soll. Das Wachstum wird dabei weniger durch die Aufnahme von Nährlösung, als vielmehr durch die begrenzte Oberflächeriausdehnung bestimmt.  Solange keine rhexigenen Erscheinungen auftreten, kommt es im inneren der Explantate zu einer erheblichen Beeinflussung der Druckverhältnisse. Daß diese Druck- und Zugbeanspruchungen zu bestimmten Differenzierungen führen können, ist seit langem bekannt (HELGER 1891 und SCHWENDENER 1894) und wiederholt bestätigt worden (BROWN und SAX 1962 sowie SWAMY und SIVARAMAKRISHNA 1975). Ihre Wechselbeziehungen im Zellverband sind jedoch sehr kompliziert und nur in sehr groben Umrissen erkennbar; z.B. dort wo die Gewebe auseinanderreißen. Daß die Zellwände sich nach solchen Belastungen ausrichten, hat in neuerer Zeit LINTILHAC (1974) durch Spannungsdoppelbrechung in einem Modell gezeigt. Dies bedeutet bei der Explantation, daß einige Zellen unter völlig neue Spannungsverhältnisse geraten und somit Translokationen von Wasser und löslichen Substanzen durch das Plasmalemma, den Tonoplasten und die Plasmodesmen erzwungen werden.  Weiterhin wird die Druckund Substanzverschiebung durch das hypotonische Nährmedium beeinflußt, das von den Zellen osmotisch aufgenommen wird und zu einer linearen Dehnung der Zellwände führt. Der unterschiedliche Dehnungskoeffizient von Leptom und Hadrom erklärt das zu beobachtende Aufreißen mancher Explantate in der Kambiumregion. Damit ergeben sich für die junge Bastregion und das Kambium die stärksten Spannungen.  In dieser Region treten häufig teilungsaktive Zentren auf.  Solche Zentren entstehen aus mehreren Zellen, wachsen allerdings nur dann zu Wurzeln bzw.  Embryonen aus, wenn sie nahe genug der Oberfläche liegen (MC WILLIAM, SMITH, STREET 1974). Auch im sog. "Contact Pressure Modelllt von ADLER (1974) das bei der Erklärung der Phyllotaxis eine wichtige Rolle spielt und auf Vorstellungen von SCHIMPER und SCHWENDENER zurückgeht, zeigt sich deutlich die Bedeutung der Spannungsverhältnisse für die Differenzierung (WARDLAW 1966, DOLEY und LEYTON 1970).

Daß das Wachstum durch den Gasaustausch von O₂ und CO₂ limitiert wird, ist unwahrscheinlich, da sich hier keine direkte Korreiation zum Frischgewichtszuwachs erkennen läßt. Sie zeigen vielmehr, daß die Zellen in den Geweben, trotz der Verletzung und des direkten Kontaktes zur Außenluft, einen Anstieg des RQ-Wertes weit über 1 erreichen, und das damit auch die alkoholischeund die Milchsäuregärung an Bedeutung gewinnt. Insbesondere die Kambiumzellen enthalten ein höheres Maß an LDH-Aktivität.

Zwei Faktoren begrenzen in den Explantcqten hauptsächlich den Gasaustausch: einerseits die angeschnittene und damit absterbende Zelllage, die eine abdichtende Schicht bildet und andererseits die Größe der Interzellularen, deren fundamentale Rolle durch die Gleichung S.24 deutlich wird. Wir können also feststellen, daß der Gasaustausch dem Wachstumsmodus folgt, ihn aber nicht ursächlich bestimmt.

Nach JAMES und RITCHIE (1955) vermag die Möhre Glukose quantitativ in Äthanol umzusetzen und nach MARSH und GODDARD (1939) kann der RQ, der bei 5 % O₂-Partialdruck einen Wert von 0,8 hat, bei nur 2 % einen Wert von 1,2 - 1,9 erreichen. übereinstimmend mit den Ergebnissen von KOMAMINE und SHIMIZU (1975) zeigt sich, daß die Zellen von Daucus car,ota L. nach der Explantation einen starken Anstieg des O₂-Verbrauchs zeigen. Dies führt zwangsläufig zu einer Verarmung der Zellen an Sauerstoff und damit zur Förderung des von KÜSTER (1925) als hyperhydi,isch bezeichneten Zustandes, wie er durch die Arioxieversuche von SCHILLING (1915) erzeugt wurde.

Zusammenfassend läßt sich also feststellen, daß das Medium, und damit auch der Gasraum, in den Kulturröhrchen festlegt, mit welcher Geschwindigkeit die Oberfläche der Explantate wachsen; aber immer ist es die Oberfläche die die Wachstumsgeschwindigkeit limitiert. In der allometrischen Gleichung bedeutet dies, daß Unterschiede der Kulturmedien Einfluß nehmen auf die Konstante b, während der Exponent a. von Streuungen abgesehen unabhängig bleibt. Die in lockeren Kalluskulturen bzw.  Suspensionskulturen zu beobachtende logarithmische Wachstumsphase folgt möglicherweise auch, dem durch Teilung potentiellen Anstieg der Oberfläche, nicht dem des Volumens. Durch die unregelmäßige Form dieser Oberflächen ist es aber schwierig hier genauere Angaben zu machen.
Diese Beobachtung steht auch im Einklang mit der embryogenetischen Wirkung des gelösten Sauerstoffs, wie sie von KESSELL und CARR (1972) und KESSELL und GOODWIN (1974) festgestellt worden ist, bei der eine kritische Sauerstoffkonzentration mit bestimmend ist, für die Zellgröße.

In den hier untersuchten Explantaten zeigte sich, daß die absolute Zahl der Zellteilungen bei Zellverbänden von 115 mg um etwa das Neunfache höher liegt, als bei solchen von 6 mg (Im Zeitraum der ersten 10 Tage). Dagegen ist die relative Teilungshäufigkeit bei solchen von 6 mg 2,7 mal so hoch, als die von 115 mg Ausgangsgewicht. Die maximale Mitosehäufigkeit am 5. bzw. 9. Tag der Kultivirung ist ein Zeichen für eine partielle Synchronisation der Zellen durch die plötzliche Explantation.  Sie spricht für den auslösenden Effekt der Transplantation und ihrer ruckartigen Verschiebung aus dem vorherigen physiologisehen Gleichgewicht.

Die Zusammensetzung des Mediums entscheidet darüber, ob Wurzeln oder Embryonen gebildet werden, während die Wachstumsrate die Häufigkeitsverteilung bestimmt mit der diese Strukturen auftreten. Man vergleiche hierzu die Ergebnisse von REINERT, BACKS-HÜSEMANN und ZERBAN (1970). Nachdem eine Kultur keine Embryonen mehr bildet, kann eine erneute Änderung der Umweltbedingungen, z.B. durch Entzug von 2,4-D als neuer Auslöser wirksam sein (MEYER-TEUTER und REINERT 1973). Eine ähnliche Überlegung hat MEINS (1975) auf Grund der Versuche von REINERT, BACKS-HÜSEMANN und ZERBAN (1970) angestellt, bei der er nachweist, daß der Anteil Embryonenbildender Kulturen den Verlauf einer Poisson Verteilung beschreibt. Die dabei aufgestellte Hypothese, daß die Kulturen mit Embryonenbildenden Zellen, diese im Laufe der Zeit verlieren, scheint jedoch wenig whrscheinlich. Vielmehr scheint die Fähigkeit der Kulturen durch die Adaptation an das Medium nach einem auslösenden Reiz bei der Explantation und dem nachfolgenden Einpendeln auf ein neues Gleichgewicht, einer Poisson-Verteilung folgend verloren zu gehen. Zumal die Anzahl embryogener Zellen beim Zerteilen einer Kultur, durch deren relative Oberflächenvergrößerung ansteigen und keinesfalls abnehmen dürfte (MC WILLIAMS, SMITH und STREET 1972).

Eine der wesentlichsten Änderungen bei der Explantation durfte neben der Verletzung und der Hydraturverschiebung der Kontakt der Zellen mit dem hypotonischen Medium sein. Die zumeist oberhalb von 400 mO liegenden Zellverbände (MOTT und STEWARD 1972), nehmen zunächst osmotisch Wasser auf, das zu einer Konzentrationsabnahme in den Geweben führt, während die darin gelösten Substanzen einen Anstieg des absoluten osmotischen Wertes in der Kultur verursachen. Deutliche osmotische Unterschiede für Holz- und Bastparenchym bzw. Kambium konnten nicht festgestellt werden. Sicherlich kommt es aber zu einem Gradienten zwischen den Medium-nahen und den Medium-fernen Zellen. Demnach ist zu Beginn der Explantation eine erhebliche Druckerhöhung in den Zellen und damit eine Dehnung der Zellwände zu beobachten, die zu den bereits erwähnten Gewebespannungen führt. Wahrscheinlich greifen dabei auch erhebliche Kräfte am Protoplasma und den Plasmodesmen an. Die im Medium gelösten Zucker und Salze, die in den "free space" passiv eingespült werden, haben eine vergleichsweise niedrige Konzentration. Dar,über hinaus muß bei einer Differenzierung von Geweben auch ein Transport von Substanzen zu bestimmten Zentren, sog. "sinks", angenommen werden, die nicht nur über die Leitbahnen erfolgen können, da diese bei der Explantation funktionslos wurden.  Hierfür bieten sich in erster Linie die Plasmodesmen an.  Sie wurden bereits von TANGL (1885) entdeckt und als "Communicationen" erkannt. Ihr Durchmesser kann zwischen 0,03 und 0,3 )i schwanken (ROBARDS 1975). BURGESS (1972) zeigte an Hand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen, daß bei der Periklinalchimäre Cytisus adamii plasmodesmenartige Verbindungen zwischen den Zellen bestehen, die nicht durch Teilung aus einer Mutterzelle entstanden sind.  Auch in jedem normalen dreidimensionalen Gewebe, wie es bei allen höheren Pflanzen vorliegt, ist es unmöglich, alle Plasmodesmen als Entstehungen bei der Zellteilung zu erklären. Es muß folglich die Möglichkeit bestehen, daß Plasmodesmen noch nachträglich dort angelegt werden, wo sie für den Symplasten unentbehrlich sind. Um solche Erscheinungen dürfte es sich handeln, bei den Übergängen von punktueller Aktivität "saurer Phosphatase" an der Zellwandoberfläche, bis hin zum Durchbruch der, Zellwand. Die Lokalisation der "sauren Phosphatase" als, hydrolytisches Enzym in der Zeilwand wurde bereits von HALPERIN (1969) bechrieben. Von HALL (1969) wurde in den intakten Plasmodesmen Adenosintriphosphatase nachgewiesen und einem aktiven Transport zugeschrieben.

Daß durch die Plasmodesmen auch größere Substanzdurchtritte möglich sind, zeigte nicht nur MIEHE (1901) spektakulär für ganze Zellkerne, sondern auch ESAU, CRONSHAW und HOEFERT (1967) für Viren. In diesem Zusammenhang ist es interessant, daß bei der Explantation die bestehenden Symplastenstrukturen z.T. funktionslos werden und neue Plasmodesmen entstehen müssen, um den veränderten Aufgaben entsprechen zu können.

Wieweit ein möglicher Transport von Zytoplasma durch die Druckunterschiede zwischen Zellen die in direktem Kontakt mit dem Medium stehen und solchen, die am weitesten entfernt sind, auftreten kann ist schwer zu sagen. Aus Plasmolyseversuchen ist bekannt, daß die Viskosität in erster Linie von den An- bzw.  Kationen abhängig ist. Damit kann nicht angenommen werden, daß die Plasmodesmen jederzeit passierbar sind (SCHUMACHER 1967), vielmehr scheinen sie eine entscheidende Rolle in der Regulation des interzellulären Transportes zu spielen. Welche der Substanzen durch die Plasmodesmen, und welche durch den "free space" der Zellwände transportiert werden ist ebenso schwer zu entscheiden. Beobachtbar ist jedoch, daß trotz der vernachlässigbar geringen Transpiration der Gewebeoberfläche dort z.B. Stärke, Proteine, DNS oder Eisenionen akkumuliert werden können.

Am Beispiel der Stärke zeigt sich ein vorüber,gehender Auflösurigsprozess, der sich im Anstieg der Zuckerkonzentration widerspiegelt. Die degradierte Stärke wird unter Mitwirkung von Phosphatasen (HUBER 1956) in Saccharose als Transportform umgewandelt, um so zu den neuen Stärke akkumulierenden Zentren zu gelangen.

Neben diesen Zentren verlieren die meisten Zellen während der Kultur sowohl an osmotischer Saugkraft als auch ah Pufferkapazität. Ihr ursprünglicher Zustand gleicht sich damit weitgehend dem Medium an, wodurch der notwendige aktive Transport und damit der Energieverbr,auch reduziert wird. Wie gering die benötigte Energie der, Explantate ist, zeigten Erlenmeyerkolben mit 50 ml Medium, (1g Saccharose) die neun Monate im Dunkelraum bei 28° C standen, und deren Explantate noch lebende Kalluszellen abgeteilt hatten. Daneben war an einigen Zellen deutlich zu erkennen, daß sie fast vollständig degradiert worden sind.
An der Degradation sind insbesondere die "sauren Phosphatasen" beteiligt, die nach MATILE (1968) hauptsächlich in den Lysosomen lokalisiert sind. Diese Lysosomenartige Partikel (CAHAN und MAPLE 1965), die auch bei der Entwicklung von Tracheen eine Rolle spielen, scheinen sich bei Pflanzen in die seit längerem bekannten Perner'schen Sphärosomen (SEMADENI 1966; HOLCOMB, HILDEBRANDT und EVERT 1967; MATILE und SPICHIGER 1968) und in Vakuolen (MATILE 1968 und MATILE 1969) umwandeln zu können. Damit sind die Vakuolen und die Sphärosomen zwei verschiedene Formen von "residual bodies", die aus den Lysosomen entstehen. Nach PARISH (1976) sind ihre sauren Hydrolasen an die Membrane gebunden. Für die oben genannte Vorstellung spricht auch der Nachweis der Esterasen, die in den anschwellenden Sphärosomen auftreten. Bei starkem Photonenbeschuß (UV-reiches Licht) können diese Kompartimente leicht zerstört werden und eine Esterase Aktivität des gesamten Zellplasmas vortäuschen. Hier zeigt sich ebenso, wie in der Druckempfinglichkeit bei der Epidermis von Cucurbita die hohe Sensibilität dieser Organellen.

Neben der großen Bedeutung der "sauren Phosphatase" im Protoplasten, scheint es nach den vorliegenden Ergebnissen, nicht weniger wichtig zu sein, weiche Rolle diese Enzyme in der Zellwand spielen. Auf die Funktion bei der Plasmodesmenentstehung wurde bereits hingewiesen. Ebenso wichtig scheint jedoch die Rolle der "sauren Phosphatabe" beim lokalen Zellwandwachstum zu sein.  Möglicherweise werden hier zum Einbau von neuen Zellulosefibrillen bestehende Bindungen gelöst und anschließend wieder neu aufgebaut, wobei die Phosphate als Energieträger furigieren. Dieses lokale Wandwachstum ist sicher auch wichtig für die Polarität, in der sich die Zellverbände befinden. Über den Transport von "saurer Phosphatase" aus dem Protoplasten heraus in die Zellwand von Daucus carota L. und ebenso über die Aktivität in Vakuole, Zellkern und Zellwand hat HALPERIN und JENSEN (1966) und HALPERIN (1969) berichtet. Bei der hier erhaltenen Verteilung, in den Dichtegradientenzentrifugationen, waren große Mengen der "sauren Phosphatasell im Präzipitat 500 x g enthalten, ein Ergebnis, das sich gut mit der Beobachtung LAMPORTIS und NORTHCOTEIS (1960) deckt, die 80 % der "sauren Phosphatase" in den Zellwänden von Acer pseudoplatanus Suspensionskulturen vermuten.

Über die Vitalflurochromierung der lysosomenartigen Partikel (DINGLE und BARRETT 1968; MAHLBERG 1972), war es möglich Beobachtungen auch an lebenden Zellen durchzuführen.  Die Lokalisation der "sauren Phosphatase" in den Zellwänden wurde auch von DE JONG, OLSON und JANSEN (1967) bei Suspensionskulturen von Tabakzellen erwähnt.  GAHAN (1969) zeigte, daß Esterasen und "saure Phosphatasen" bei der Siebporenbildung auftreten.
Damit erscheint die in der vorliegenden Arbeit gemachte Beobachtung, daß die "saure Phosphatase" bei der Anlage neuer Plasmodesmen beteiligt sind und so die Kommunikationsbahnen des polyenei,giden Symplasten den neuen Erfordernissen bei der Explantation anpassen, durchaus wahrscheinlich.
Als Enzym im Plasmalemma wurde die ATPase untersucht, die interessanterweise nicht gleichmäßig über die gesamte protoplasmatische Oberfläche verteilt ist.  Besonders deutlich wird diese Bevorzugung bestimmter Areale bei den Tracheiden.

Für den interzellularen Transport von Redoxkörpern scheint die Lokalisation der Peroxidasen wichtig zu sein. Dieses vorwiegend in der Mittellamelle lokalisierte Enzym spielt nach LIPETZ und GARRO (1965) sowie HEPLER, RICE und TERRANOVA (1972) für die Ligninbildung in jungen Tracheen und nach HALL (1972) auch noch für das reife Xylem eine Rolle.

In der Explantation zeigte sich auch, daß bestimmte Orte mit einem erhöhten Redoxpotential, und andere mit stark reduktiver Fähigkeit entstehen. Insbesondere die Zentren hoher Teilungsaktivität, wie auch das Kambium der Rübe zeichnen sich durch eine starke Verminderung des Redoxpotentials aus. Nach BETZ (1958) schafft die Gärung solche Räume niederen Redoxpotentials. Demnach kommt es Überall dort, wo Zellen unter dem Druck des umliegenden Gewebes eine Verringerung der Interzellularen aufweisen, zu einem Sauerstoffmangel und somit zu erhöhter Reduktivität. Dies zeigt sich einerseits daran, daß die Blindreaktionen bei den Dehydrogenasen ohne Zusatz an NADH+H⁺ sog. "nothing dehydrogenases" aufweisen (ARNOLD 1968). Andererseits lassen z.B. die GDH und die LDH im Kambium und in den Zentren einen zusätzlichen Aktivitätsanstieg erkennen. Durch die zunehmende Teilungsaktivität der Kulturen zeigte sich auch ein Anstieg in der Gesamtaktivität der Dehydrogenasen. Ebenso nimmt der Anteil an zweiwertigen Eisenionen sowie an Ascorbinsäure während der ersten Tage der Kultivierung zeitweilig zu. Die Fe⁺⁺-Ionen erwiesen sich bei den Explantaten als wichtiges Spurenelement bei der Tracheenbildung. Sie müssen soweit sie aus dem Medium stammen reduziert werden. In den weiter ausdifferenzierten Tracheen fanden sich vorwiegend F⁺⁺⁺-Ionen. Beim funktionellen Obergang der Tracheen in reine Leitelemente werden die Degradationsprodukte abtransportiert. Dabei soll nach SHELDRAKE und NORTHCOTE (1968) auch IES entstehen. Das Tracheen die Differenzierung von Embryonen maßgeblich entscheiden, zeigt sich daran, daß die Zentren erhöhter Teilungsaktivität durch die Lokalisation der Tracheenbildungdeterminiert werden, ob ein Wurzelpol, ein Sproßpol oder ein Embryo entsteht. Die Zentren selbst müssen anfangs noch als uniform meristematisch (GUPTA 1972), d.h. als undifferenziert angesehen werden. Das die Tracheen vor den Siebelementen differenziert werden haben BORNMAN, ABBOTT, NOEL und SNIJMAN (1976) beobachtet.

Kambiumzellen können direkt lignifiziert werden.  Eine vorhergehende Teilung (FOSKET 1972) ist nicht notwendig. Damit zeigt sich klar die Fähigkeit verschiedene Spezialisierungen ansteuern zu können, ohne eine differentielle Zellteilung zu durchlaufen.

Ein entscheidender Faktor für die ortsabhängige Differenzierung ist das Vorliegen von Gradienten, die den Zustand eines Gewebes bestimmen und seine Entwicklung determinieren. Solche Gradienten können endogen, durch Produktion bestimmter Substanzen an festgelegten Orten, oder exogen, beispielsweise durch eindiffundierenden Sauerstoff, entstehen. Dabei reguliert das Gewebe jedoch auch diese exogen induzierten Gradienten, durch die Beschaffenheit der Oberfläche, die Größe des Interzellularraumes und den Verbrauch der einzelnen Zellen. Orte hohen Sauerstoffverbrauchs sind neben den Mitochondrien mit ihren Cytochromoxidasen, die Zellen mit einem hohen Phenolase Gehalt, bei denen die entsprechenden Substrate zur Verfügung stehen. Dies wird besonders deutlich bei den Pflanzenarten, die bei der Explantation starke Braunfärbung zeigen, wie beispielsweise bei Musa ensetes oder Sinningia hybrida. Daucus carota zeigt diese Bildung von Polyphenolen nicht und erwies sich auch als fast völlig frei von Brerizcatechiri oxidierenden Phenolasen. Während der Kultur steigt die Aktivität der Phenolasen stark an, ohne eine Braunfärbung der stark wachsenden Gewebe zu erzeugen. Überträgt man die Kulturen in Intervallen von mehr als vier Wochen, so werden die melaninartigen Verbindungen sichtbar. Das bedeutet entweder, daß es zu einer erhöhten Bildung von Substrat kommt, oder die Polyphenoloxidasen durch Aufhebung einer vorhandenen Kompartimentierung zu ihren Substraten gelangen. Nach KAUPERT (1958) soll Brenzcatechin für die Verkorkung verletzter Zellen wichtig sein.

Durch den Aktivitätsanstieg der Enzyme kann es einerseits zu einer Verarmung an Substrat und anderseits zu einer Anhäufung des Produktes gekommen sein.  So ist es denkbar, daß die verstärkte Bildung von Tracheiden und damit von Lignin, auf den Anstieg der Peroxidaseaktivität zurückzuführen ist. Die Folge wäre, daß bei rasch wachsenden Kulturen die Fähigkeit zur Differenzierung von weiteren Leitelementen langsam absinkt. Nur in einer ausgewogenen Arbeitsteilung, die bei der Explantation empfindlich gestört wurde, kann das Verhältnis von Substrat und Produkt dem Bedarf an morphogenetischer Entwicklung angepaßt werden. Die starke Tendenz zur Tracheidenbildung zeigt sich auch in den Versuchen von KOHLENBACH und SCHMIDT (1975), in denen Mesophyllzellen ohne vorherige Teilung in Tracheiden umdifferenziert wurden.

Substanzen, die nur in Zusammenarbeit verschiedener Gewebe synthetisiert werden, d.h. durch Zulieferung bestimmter Vorstufen, können bei der Kultivierung verloren gehen. Erst eine neue einsetzende Arbeitsteilung kann die Voraussetzung für die Synthese solcher Substanzen bieten. Es ist damit kaum zu erwarten, daß beispielweise eine Suspension weitgehend gleicher einzelner Kalluszellen zu solchen Syntheseleistungen in der Lage sind, die eine Korrelation der Gewebe voraussetzen.

Da bei den Karotinoiden die Konzentration in den Geweben im gleichen Maße abnahm, als das Frischgewicht anstieg, ist hier die absolute Menge pro Kultur konstant geblieben. Die Explantate scheinen also ihre Fähigkeit zur de novo Synthese verloren zu haben, obwohl die Zellen ursprünglich die notwendige Enzymgarnitur, zur Bildung der charakteristischen Karotinoidkristalle besaßen. Es fehlen ihnen nach der Explantation entweder die notwendigen Vorstufen oder entsprechende, für die Korrelation wichtige Auslöser dieser Syntheseleistung.

In einem Zellfaden, in dem nach (DE JONG, JANSEN und OLSON 1967), nur jede dritte Zelle aktive Succinatdehydrogenase zeigte muß eine solche Kommunikation existiert, haben. Bei den endogenen Zuständen spielt die Polyploidisierung eine erhebliche Rolle. Sie verschiebt das Verhältnis von Volumen zur Oberfläche der Zellen zugunsten des Volumens. Nach WINKLER (1916) soll die Polyploidisierung für die Pflanze den Sinn haben, große Zellen zu erreichen.  Solche Kalluszellen beinhalten sehr große Vakuolen, so daß ihre Volumenvergrößerung weitgehend einer Aufnahme von Wasser und darin gelösten Nqhrsalzen entspricht.  Es erscheint für die Zellen vorteilhaft zu sein, um die notwendigen Nährsalze aufnehmen zu können, große Mengen an Medium zu imbibieren. Dies zeigen auch Versuche von PARTANEN (1965) und von BAYLISS (1975) sowie SINGH und HARVEY (1975), die bei verzögerter Obertragungszeit eine erhöhte Zahl an Polyploidisierungen fanden. Möglicherweise erreicht die Zelle bei stetigem Wachstum nicht das Stadium der Teilungsbereitschaft, so daß es ohne Zelltrennung zu Polyploidisierung kommt.  Auch mehrkernige Zellen sind immer wieder aufgetreten. Daß es in einem solchen Zustand der Zellen immer seltener zu Embryogenesen kommt ist von TORREY (1967) beschrieben worden. Polyploide Embryonen bzw. Wurzelbildungen konnten in der vorliegenden Arbeit nicht beobachtet werden. Soweit Kerne gemessen wurden, die unterhalb der 2C-Klasse lagen, dürfte es sich um Degradationserscheinungen handeln (REINERT und KÜSTER 1966). Die von SMITH und STREET (1974) aufgestellte sog. genetische Hypothese, nach der die Polyploidisierung eine Selektion der Zellen darstellt, die ihre embryogenetische Potenz verloren haben, bestätigt, daß polyploide Zellen den diploiden gegenüber im Vorteil sind. Hier liegt vermutlich das günstigere Verhältnis beim allometrischen Wachstum. Trotzdem darf nicht vergessen werden, daß diese polyploiden Zellen immer nur Entwicklungen aus diploiden Zellen darstellen, und daß die Drift zur Polyploidisierung hin, in höheren Pflanzen eine häufige Erscheinung ist.

Die Verteilung von zwei Jahre alten Suspensionskulturen zeigt, daß die 4C-, 8C- und 16C-Kerne etwa die gleiche Häufigkeit von 22-26 % haben, während sich die restlichen 9 % bzw. 13 % auf die 2C- und 32C-Kerne verteilen.  In den 4C-, 8C- und 16C-Klassen sind jeweils gemeinsam Kerne der G1- und G2-Phase enthalten, während in den 2C- und 32C-Klassen nur die G1- bzw.  G2-Phase auftritt. Die S-Phase wurde, meist in vernachlässigbar kurzer Zeit durchlaufen.  Dies zeigt die geringe "Schiefe" der einzelnen peaks.  Das konstante Auftreten von 2C-Kernen, neben den polyploiden Kernen zeigt, daß genetisch gesehen die Embryogenese noch möglich sein sollte, obwohl bei den zwei Jahre alten Kulturen die Fähigkeit längst erloschen war. Der Wettbewerb um die verfügbaren Kohlenstoffquellen im Sinne von SMITH und STREET (1974) hat diesen Anteil an 2C-Kernen nicht zu unterdrücken vermocht. Hinzu kommt, daß die Polyploidisierung bereits in den ersten Tagen der Kultivierung einsetzt, zu einer Zeit, in der die Embryogenese erst eingeleitet wird. Die Vorstellung über die Beteiligung von Morphogenen (NARAYANASWAMY 1977) an der Embryogenese erscheinen somit einleuchtender.

Die in der vorliegenden Arbeit dargelegte Interpretation des Differenzierungsgeschehens ist ein Versuch, auch Effekte physikalischer Faktoren auf die Organogenese, zu berücksichtigen. Sie spielen neben den Modellvorstellungen von WARDLAW (1952) und MEINHAADT (1974), der einen langsam diffundierenden Aktivator und eine Inhibition für die Verteilungsmuster von Morphogenen annimmt, und WOLPERT (1970) der die Vorstellung des "french flag models" benutzt, um die Übertragung von Information zu erklären, ein-e wichtige Rolle. BERTALANFFY (1951) hat auf die Bedeutung des allometrischen Wachstums im Sinne von RENSCH (1954), bei der Volumen-Oberflächen-Relation hingewiesen. Sie ist entscheidend beteiligt an den proportionalen Entwicklungen der Organe und damit an der Erklärbarkeit von Bauplanänderungen durch Koordinatentransformation (THOMPSON 1917). Versucht man solche Relationen durch "source-sink-Diffusionsgradienten" von Morphogenen zu beschreiben, so berechnet sich nach CRICK (1970) eine Reichweite von etwa einem Millimeter. Dies erklärt möglicherweise Differenzierungen innerhalb einer oder mehrerer Zellen, kaum aber die von Geweben und Organen. Dagegen wäre die Verstärkung eines Signals, das von einer Zelle abgegeben und jeweils von den Empfängerzellen wieder neu ausgestrahlt wird, eine Erklärung, die auch Informationen über größere Reichweiten in kürzerer Zeit ermöglicht.  Dabei kommt es nach GERISCH (19171) bei Dictyostelium discoideum zu Erregungswellen, die das morphogenetische Feld durchlaufen. Nach GERISCH und HESS(1974) kontrolliert Cyclisches-AMP diese Oszillationen, die durch die autokatalytische Abhängigkeit von ATP-Pyrophosphohydrolase und Adenylcyclase erklärbar ist (GOLDBETER 1975).

Ein entscheidender Unterschied zu diesem vergleichsweise einfachen System, liegt bei den Explantaten von Daucus carota in dem Vorhandensein von Plasmodesmen, die durch ihre Kommunikation unter den gegebenen Druckverhältnissen weit kompliziertere Möglichkeiten der Informations- und Substanzübertragung bieten. Trotzdem scheinen auch hier Oszillationen im Transport von Substanzen auftreten zu können, wie sie SHERIFF (1974) für die Sprosse höherer Pflanzen nachgewiesen hat.

Zusammenfassung

Es wurde ein allometrischer Zusammenhang zwischen der Frischgewichtszunahme und der Oberflächengröße der Gewebekulturen, von Daucus carota L. einerseits und der Abhängigkeit vom Kulturmedium anderseits festgestellt. Damit läßt sich die Bedeutung der Medien mit unterschiedlich morphogenetischer Stimulation klarer abgrenzen als bisher.

Im Zusammenhang mit der Oberfläche stehen Bestimmungen des Gasaustausches, der Atmung und der Gewebespannung. So ließen sich aus der elastischen Dehnung der Gewebe und ihren osmotischen Verhältnissen größere Spannungen erkennen, die unter den Schnittkanten und im Grenzbereich zwischen Phloem und Kambium auftreten. Dort wo sich meist teilungsaktive Zentren bilden, die sich des öfteren zu Embryoiden bzw. wurzelartigen Strukturen entwickeln.

Die zu beobachtende Gärung bringt einen Anstieg an Alkoholdehydrogenase und Laktatdehydrogenase mit sich, der in den gleichen Zellregionen seine höchsten Werte aufweist Zum Vergleich hierzu wurden die Peroxidasen, Cytochromoxidasen und Phenoloxidasen in ihren Aktivitäten bestimmt.

Die "saure Phosphatasell ist vermutlich nicht nur an der Degadation von Protoplasma beteiligt, sondern nimmt wahrscheinlich auch an der partiellen Lösung von Zellwandverknüpfungen teil. Ihre Bedeutung für die Entstehung von interzellulären Kommunikationen bei der neu einsetzenden Differenzierung wird diskutiert.

Wieweit die Differenzierung eine Umverteilung von Substanzen mit sich bringt zeigen Bestimmungen der, Zucker-, Stärke-, Protein- und DNS-Verteilung in den Zellwänden.

Wenige Tage nach der Explantation ergaben zytofluorometrische Messungen bereits eine beginnende Polyploidisierung, die sich im Laufe der weiteren Monate bis zu den 32C-Kernen steigert. Unabhängig davon blieben jedoch die Embryonen stets diploid.

Die Funktion von Eisenionen für die Tracheenentstehung ließ sich histochemisch zeigen. Dabei spielt das Redoxpotential eine Rolle, das seinerseits durch die pH-Situation beeinflußt wird, und somit näher untersucht werden mußte. In diesem Zusammenhang wurde auch ein Anstieg an Ascorbinsäure nachgewiesen.

Daß die Zellen einen Teil ihres ursprünglich spezifischen Stoffwechsels während der Kultur einbüßen, ersieht man aus dem Verlust an Karotinoiden.

In welcher Weise die Zellen zu einer Anpassung an das Medium fähig sind, und damit die potentielle physiologische Toleranz, zeigt sich in der Umdifferenzierung des Kambiums. Diese kambialen Zellen, die in der Rübe zur Bildung von Bast determiniert waren, wurden direkt, d.h. ohne Teilung, in Tracheiden umgewandelt.  Dabei durchlaufen die Kambiumzellen während der Anpassungsphase an das Medium ein Streckungswachstum, das sie vorübergehend zu parerichymatischen Zellen werden läßt. Auch ältere parenchymatische Zellen der Holz- und Bastregion konnten sich direkt zu Tracheiden umdifferenzieren.
 

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Last update: 21.2.1999 © by Walther Umstaetter